研究文章 免疫学

Tim-3适配器蛋白Bat3是T细胞终末分化和衰竭的分子检查点

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十搏欧洲杯直播官网2021年4月30日:
7卷,没有。18日,eabd2710
DOI:10.1126 / sciadv.abd2710

抽象的

T细胞疲惫与持续性病毒感染和癌症的预后差有关。相反,在自身免疫的背景下,T细胞疲惫与长期临床结果有利相关。了解自身免疫设置中耗尽的发展可能提供潜在的原则,可以利用到Quell自动反应性T细胞。在这里,我们证明了适配器分子BAT3作为T细胞耗尽的分子检查点,缺乏BAT3促进深度耗尽表型,抑制自身反应性T细胞介导的神经炎性炎症。机械地,BAT3充当抑制AKT功能的关键MTORC2抑制剂。结果,BAT3缺乏导致AKT活性和FOXO1磷酸化增加,间接促进PRDM1表达式。转录分析Bat3−−/T细胞揭示了功能障碍相关基因的上调,伴随着与T细胞效应函数相关的基因的下调,表明缺乏BAT3可以在高度炎症自身免疫条件下触发T细胞功能障碍。

介绍

Bat3是一种泛素类蛋白,具有多种生物学功能,包括调节细胞凋亡(1)、蛋白质乙酰化(2)和主要的组织相容性复合物(MHC)II类表达(3.)。此外,作为热休克蛋白Hsp70 / hsc70的伴侣(4),BAT3也参与蛋白质重折叠和蛋白质合成的质量控制(5)。BAT3基因(袋子6.)位于与肿瘤坏死因子(TNF)基因座相邻的MHC III集群中。BAT3基因座中的单核苷酸多态性与I型糖尿病有关(6)及癌症(7- - - - - -9)然而,对于BAT3在调节免疫应答方面的作用很少。

我们之前已经表明,BAT3是一种衔接蛋白,其结合和负面调节TIM-3,检查点抑制剂在实验上公认,并且在患者中,作为自身免疫,癌症和慢性病毒感染的免疫应答的重要负调节因子(10.- - - - - -13.)。然而,Bat3和Tim-3相互作用调节T细胞反应,包括T细胞激活或衰竭的机制尚未完全阐明。为了解决这个问题,我们创造了这两个Bat3FL / FL.Tim-3FL / FL.利用自身免疫疾病模型在体内研究Bat3和Tim-3之间的相互作用。在这里,我们表明,亏损Bat3 T细胞导致减少炎性细胞因子与Tim-3相应增加,KLRG1(杀手细胞lectin-like受体G1)和白细胞介素- 10”(il - 10),结果在减少疾病在一个被动的实验性自身免疫性脑脊髓炎的传输模型(运算单元)。Tim-3信号在一定程度上导致了Bat3介导的T细胞衰竭,进一步的机制研究让我们假设Bat3可能是mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)的关键调控因子。我们发现,Bat3通过限制Hsc70的作用,优先抑制mTORC2 (mTOR complex 2)的活性,而Hsc70被认为可以增强mTORC2的功能。因此,Bat3缺失导致Akt活性增加,FoxO1磷酸化,从而抑制其转录活性,间接促进PRDM1表达式。PRDM1 / Blimp-1的这种增​​加促进了在包括TiM-3和IL-10的卷积分子模块的表达,我们以前在肿瘤渗透T细胞中鉴定(14.)。为了支持这一点,对差异表达(DE)基因的分析Bat3- 和Tim-3-deficient T helper 1 (TH1)细胞显示大量的DE基因重叠Bat3- 在CD8肿瘤渗透淋巴细胞(TIL)中观察到耗尽模块的缺陷T细胞(15.),进一步表明BAT3可能在缩减T细胞功能障碍中发挥关键作用。

在这里,我们发现了一个之前未被确认的机制,通过该机制,Bat3不仅直接抑制Tim-3信号通路,而且在控制mTORC2-Akt-Blimp-1通路中发挥关键作用,从而抑制Tim-3的诱导,防止T细胞的终端分化和功能障碍。

结果

Tim-3信号部分有助于bat3介导的T细胞衰竭

我们之前已经证明了Bat3与Tim-3的细胞质尾巴结合并抑制其下游信号传导。然而,Tim-3:Bat3相互作用调节T细胞反应的机制,包括T细胞激活或衰竭,尚未完全阐明。为了深入了解Bat3在脑源性T细胞反应效应阶段调控T细胞反应中的作用,我们生成了Bat3通过交叉的条件敲除小鼠Bat3FL / FL.×CD4Cre(Bat3cko)小鼠(设计Bat3FL / FL.如图所示。S1)。用沼泽积极免疫35-55/ CFA(髓鞘寡核腺细胞糖蛋白35-55/完全弗罗因德的辅助)Bat3cko与野生型(WT)凋落物小鼠相比,小鼠显示减弱疾病严重程度(Bat3FL / FL.)(图。S2)。但是,因为CD4CRE可以在包括CD4的多种细胞类型中删除基因+, CD8+和foxp3.+T细胞,我们希望确定BAT3损失的损失在脑生成效应器T细胞上。因此,我们生成了Bat3cko×2d2.老鼠跨越Bat3cko髓鞘抗原玉米老鼠35-55特异性T细胞受体(TCR)转基因小鼠(16.)。正如Tim-3优先表达于T.H1和Tc1细胞(17.),我们从Bat3cko×2d2.Bat3FL / FL.×2d2.小鼠,体外将细胞分化为tH1个细胞,并将它们转移到C57BL / 6受体小鼠中以追随EAE的发展。我们发现了Bat3cko×2d2.TH1细胞转移小鼠发生EAE的严重程度明显低于Bat3FL / FL.×2d2.(wt)tH1细胞转移的小鼠,表明BAT3的丧失减少了效应T的脑生成潜力H1个细胞(图。1A)。当我们转移体外分化的致病性时H17个细胞Bat3cko×2d2.Bat3FL / FL.×2d2.小鼠进入B6小鼠,在这两个实验组之间发现了疾病进展或严重程度的差异(图S3)。因此,被动EAE结果证明了BAT3在效应器中的特定作用H1细胞。

Fig. 1 Tim-3 signaling partially contributes to Bat3-mediated T cell exhaustion.

(A) CD4 T cells from Bat3cko × 2D2 and WT 2D2 mice were in vitro differentiated into TH1 cells, and 4 × 106 cells were transferred into C57BL/6 recipient mice to induce EAE. Disease progression was monitored on daily basis until the end of the experiment. Mean disease scores are shown as indicated. (B to E) Ex vivo analyses on transferred 2D2 cells (Va3.2+Vb11+) in the central nervous system (CNS), spleen (SPN), and lymph node (LN) on day 12 (D12) and day 21 (D21) were performed to determine the phenotype of Bat3-deficient CD4 T cells during EAE induction. Error bars indicate mean SEM [*P = 0.01, **P = 0.0085, and ***P = 0.006, unpaired two-tailed t test; ****P = 0.0001, two-way analysis of variance (ANOVA)]. NS, not significant. (F) Naïve CD4 T cells were isolated from Bat3fl/fl, Tim-3cko, Bat3cko × 2D2, and Tim-3×Bat3dko × 2D2 mice and were in vitro differentiated into TH1 cells; 4 × 106 cells were transferred into C57BL/6 recipient mice to induce EAE. Disease progression was monitored on daily basis till the end of experiment. Mean disease scores were shown as indicated. Statistical significance between Tim-3cko × 2D2 and Tim-3×Bat3dko × 2D2 was reached on D12 (**), increasing in significance until cessation of experiment. Statistical significance between Bat3cko × 2D2 and Tim-3 × Bat3dko × 2D2 mice was reached on D8 (*), increasing in significance until cessation of experiment. (G) Ex vivo analyses on transferred 2D2 cells (Va3.2+Vb11+) in the CNS on D21 was performed to determine the phenotype of Bat3fl/fl, Tim-3cko, Bat3cko × 2D2, and Tim-3 × Bat3dko–deficient CD4 T cells during EAE induction. Data represent three independent experiments. Error bars indicate mean SEM (*P = 0.01 and ***P = 0.0012, unpaired two-tailed t test; ****P = 0.0001, two-way ANOVA).

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图。1 Tim-3信号传导部分有助于BAT3介导的T细胞耗尽。

(一个)CD4 T细胞来自Bat3cko×2d2.WT 2 d2小鼠的体外分化为tH1个细胞,4×106转染C57BL/6受体小鼠诱导EAE。每天监测疾病进展直到实验结束。平均疾病得分如图所示。(BE)在转移的2D2细胞上进行体内分析(Va3.2+Vb11+在EAE诱导的第12天(D12)和第21天(D21)检测中枢神经系统(CNS)、脾脏(SPN)和淋巴结(LN)中bat3缺失的CD4 T细胞的表型。误差条表示平均SEM [*]P= 0.01,**P= 0.0085,和***P= 0.006,未配对双尾t测试;* * * *P= 0.0001,双向方差分析(ANOVA)]。ns,不重要。(F)野生CD4 T细胞Bat3FL / FL.,Tim-3cko.,Bat3cko×2d2.,Tim-3×Bat3dko×2d2.小鼠,体外分化为tH1个细胞;4×10.6转染C57BL/6受体小鼠诱导EAE。每天监测疾病进展情况,直至实验结束。平均疾病评分如图所示。之间的统计学意义Tim-3cko.×2d2.Tim-3×Bat3dko×2d2.在D12时达到(**),显著性增加,直至实验结束。之间的统计学意义Bat3cko×2d2.Tim-3×Bat3dko×2d2.达到D8(*)达到小鼠,其意义增加,直到试验停止。(G)在转移的2D2细胞上进行体内分析(Va3.2+Vb11+),以确定表型Bat3FL / FL.,Tim-3cko.,Bat3cko×2d2.,Tim-3×Bat3dko- EAE诱导期间的CD4 T细胞。数据代表三个独立实验。误差栏表示均值SEM(*P= 0.01和***P= 0.0012,未配对两尾t测试;* * * *P= 0.0001,双向方差分析)。

我们接下来评估转移的表型Bat3FL / FL.BAT3CKO 2D2TH在发病后(移植后第12天),发现tim3表达细胞在中枢神经系统(CNS)的频率较高Bat3ckoT细胞。然而,BAT3CKO 2D2细胞显示出较高百分比的干扰素-γ(IFN-γ)阳性,尽管伴随着IL-10增加(图。1B)。IFN-γ人口的意外增加Bat3ckoTH1导致我们考虑这些细胞的效应状态是否有变化。因此,我们分析了中枢神经系统浸润转移2d2.+TH用于所选效应T细胞的选定标记的1个细胞,并发现记忆标记IL-7R(CD127)的表达减少,但增强了效应分子KLRG1的表达Bat3cko×2d2.TH1个细胞(图。1B)。此外,在没有BAT3的情况下,来自外周淋巴结器官(淋巴结和脾脏)的2D2 T细胞上的CD62L表达显着降低;但是,CNS中没有观察到差异(图1C.)。虽然相同数量的Bat3cko×2d2.Bat3FL / FL.×2d2TH将1个细胞转移到受体C57BL / 6小鼠中,在第12天没有检测到细胞频率的差异,有一个明显的减少Bat3cko×2d2.TH在转移后第21天在CNS内1细胞,表明转移T的更快收缩H1个缺乏Bat3的细胞(图。1D)。在移植后第21天测量细胞因子的产生时,我们发现IFN-γ和IL-2显著减少,但IL-10水平持续升高Bat3FL / FL.×2d2.细胞(图1E.)。虽然Tim-3表达在该疾病的这种阶段没有差异,但我们确实观察到CNS渗透T细胞上的PD-1(编程细胞死亡蛋白1)的表达减少(图S4)。集体,这些结果表明Bat3cko×2d2.TH1细胞加速终末分化,并易于在体内发展一个功能失调的表型。

为了确认这些发现,我们使用了一种良好的体外系统,其中naïve(CD62L)CD4+在驱动T的条件下连续培养和重新培养(偏振)T细胞H1反应。在这些长期激活的条件下,TH1细胞通过第三次连续极化表达高水平的Tim-3 (17.)。使用这种方法,我们发现Bat3ckoTH1分化的细胞实际上产生的IFN-γ比Bat3FL / FL.TH第一轮偏振期间的1个细胞。但是,BAT3缺陷H经过三轮极化后,细胞失去了产生IFN-γ的能力(图S5)。

我们之前已经表明,T细胞中BAT3的缺乏不仅增加了TIM-3表达,而且还导致增强的TIM-3功能(11.)。但是,目前尚不清楚升高的TIM-3表达是否有助于观察到的表型Bat3ckoCD4 T细胞(图。1A),或者Tim-3表达和信号通路的增加仅仅是T细胞中Bat3缺失的生物学结果。

为了更好地了解BAT3介导的T细胞功能障碍背后的分子机制,我们在T细胞中产生了BAT3和TIM-3单和双条件敲除小鼠(通过横穿CD4Cre转基因小鼠)。专注于TIM-3和BAT3对T的作用H1 .免疫,我们进一步繁殖Tim-3FL / FL.×CD4Cre(Tim-3cko.),Bat3FL / FL.×Tim-3FL / FL.×CD4Cre(Tim-3×Bat3dko)小鼠2d2.TCR转基因背景(16.)。使用来自这些小鼠的CD4 T细胞,我们产生了H将四种基因型的细胞移入C57BL/6小鼠中诱导EAE。结果与图。1A,Bat3cko×2d2.TH1个细胞诱导非常温和的EAE,而Tim-3cko.×2d2.TH1细胞诱导的EAE明显比WT严重Bat3FL / FL.×2d2 t.H1细胞。伴随删除Tim-3和BAT3(TIM-3BAT3DKO×2d2.TH1细胞)完全逆转脑炎表型Bat3cko2D2 T.H1细胞并显示EAE类似于在WT小鼠中观察到的EAE(图。1F.)。考虑到它们诱导疾病的能力增强,我们发现中枢神经系统浸润Tim-3cko.×2d2.TH1细胞显示IFN-γ和IL-2相对于对照的产生。这Tim-3×蝙蝠3 dko × 2D2[双敲除(DKO)] TH1个细胞共享功能Bat3cko×2d2.TH1细胞和Tim-3cko.×2d2.Th1细胞。检查IFN-γ生产,DKO表现得更多Tim-3cko。然而,关于IL-2, DKO细胞看起来更具有可比性Bat3ckoT细胞。

但是,总的来说,CNS渗透效应器T的频率H1个细胞(CD44+;KLRG1+)Tim-3×Bat3dko和……相似吗Tim-3cko.和wt t.H1个细胞,表明删除Tim-3救出了蝙蝠3缺乏的表型缺陷H1细胞分化(图1G.)。综上所述,这些结果表明Tim-3信号在很大程度上参与了Bat3缺陷表型,Tim-3的缺失足以挽救Bat3缺陷T的致病性H无源EAE诱导过程中的1个细胞。

Tim-3+TH1个细胞代表终末分化和功能障碍T细胞

尽管在EAE诱导期间,可以在CNS渗透T细胞上检测到高水平的TIM-3,但是迄今为止表征这些TIM-3表达的细胞。检查TIM-3表达在体内T细胞扩张中的作用,我们用沼泽免疫C57BL / 6小鼠35-55/CFA诱导EAE。在疾病高峰期(第10天),我们在分离cns浸润效应CD4前1天给小鼠注射5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)+(Foxp3.-) T细胞。通过流式细胞仪分析,我们发现brdu掺入的增殖细胞主要是Tim-3-CD4 T细胞。相比之下,Tim-3+细胞大多是Brdu阴性,表明TIM-3+CD4 T细胞在体内未增殖。相反,PD-1表达在很大程度上与BRDU掺入相关,与在最近活化和增殖细胞上表达PD-1的数据一致,在其他研究中已注意的发现(19.)。我们还计算了Brdu之间的比率(折叠)差异+PD-1+/ BrdU+PD-1-和BrdU+Tim-3+/ BrdU+Tim-3-细胞。主要是PD-1+而不是PD-1-,都贴上BrdU的标签。相比之下,主要是Tim-3+细胞,但不是tim-3-细胞,是Brdu阴性(图2A)。这些结果清楚地表明,Tim-3和PD-1在炎症过程中控制效应CD4 T细胞反应中有不同的作用,而且Tim-3的表达可能在体内对抗T细胞增殖。

图2 Tim-3+TH1个细胞代表末端分化和功能障碍T细胞。

(一个) WT (Foxp3-GFP.用MOG免疫KI)小鼠35-55/CFA诱导EAE。在疾病的峰值(第10天),免疫小鼠用Brdu腹膜内注射,并在第二天进行了安乐死以分离CNS浸润的CD4+FoxP3-用于流式细胞术分析的T细胞。流式细胞术数据(左侧)表示来自同一实验的4只小鼠的结果。此外,Brdu之间的比率(折叠)差异+PD-1+/ Brdu+PD-1-和Brdu.+Tim-3+/ Brdu+Tim-3-用比对分析细胞t测试并显示为右侧(P= 0.0048)。(B)Foxp3-GFP ki用沼泽免疫小鼠35-55/CFA诱导EAE。在疾病的峰值(第10天),Tim-3+FoxP3-和tim-3-FoxP3-采用细胞分选法从EAE小鼠中枢神经系统分离CD4 T细胞。使用内部设计的纳米串编码集(14.)。分析来自三个EAE小鼠的细胞,如在每个单独的柱中所示。(C) WT小鼠用MOG免疫35-55/CFA诱导EAE。第14天,分离浸润cns的T细胞。CD4.+Foxp3.-;Tim-3嗨/罗通过流式细胞术分析细胞以表达PD-1,CD160和KLRG1。(c)显示为平均值±sem。*P<0.05;***P< 0.001;* * * *P< 0.0001 (Student双尾t测试)。

我们接下来希望探讨TIM-3信令对EAE背景下的效应CD4 T细胞功能的影响。排除TIM-3+Foxp3.+T细胞,我们用沼泽免疫Foxp3-绿色荧光蛋白(GFP)敲击小鼠35-55/ CFA,随后被隔离蒂姆-3+FoxP3-和tim-3-FoxP3-来自沼泽免疫动物的CNS的CD4 T细胞,并对这些细胞进行纳米过度分析。随着我们观察到在BAT3缺陷T细胞上获取功能障碍表型,我们使用了代表功能失调的CD8的自定义代码集+TIL基因签名(245个基因),在效应CD4 T细胞调节中询问TIM-3的潜在作用。因为IL-27调节的卷中模块和功能障碍CD8之间存在重叠+直到签名(14.),IL-27是通过转录因子T-BET,NFIL3和BLIMP-1的TIM-3表达的重要调节因子(14.,19.),我们进一步包括从IL-27驱动的基因签名中设置的自定义基因,总共397个基因。我们发现了94个基因,26个更具表现力Tim-3+细胞和68在TIM-3更高表达-细胞。进一步分析表明Tim-3的表达谱+细胞表现出高度富集的PRDM1Nfil3(图。2B),支持我们之前对这些转录因子的关键作用的观察Tim-3基因表达 (14.,19.)。相比之下,Tim-3-CD4.+T细胞水平明显升高TCF7.,BCL2.,FOXO1所有这些都被证明促进内存和干燥的T细胞,但抑制了效应T细胞分化和增殖能力(图。2B)。Tim-3+T细胞还表现出其他检查点抑制剂的表达升高,包括Lag3PDCD1.并失去了表达的能力il2.,这对细胞存活很重要。因为这些细胞仍然能够在功能上表达IFNG.TNFA,tim-3+从CNS炎症峰的小鼠收集的T细胞表型类似的终端差异效应器H1 T细胞。

我们进一步分析了MOG主动诱导EAE 12天后小鼠cns浸润CD4效应T细胞35-55免疫。我们发现近100%的Tim-3CD4 T细胞共同表达PD-1,但很少少数TIM-3细胞pd-1阴性。此外,我们研究了KLRG1和CD160的表达水平,终端分化的广泛欣赏标记,并发现在TIM-3上增加了表达与Tim-3相比细胞(图2C.)。我们进一步研究了这两种群体中细胞因子的表达,发现IFN-γ的显着升高,而TNF-α保持不变。IL-2显着降低,这与我们使用BAT3CKO T细胞的研究结果符合(图2C.)。这些数据显示,TIM-3TH1细胞表现出终末分化效应细胞的基本特征。

BAT3缺乏导致S473增加Akt磷酸化

因此,我们的数据表明BAT3缺陷的T细胞具有升高的TIM-3表达,可以在激活时经历加速收缩。我们之前表明TIM-3与TCR相关的细胞内激酶LCK(11.),这让我们质疑Bat3在TCR激活下游的作用。为了进一步了解Bat3在T细胞激活中的作用,我们从Bat3ckoBat3FL / FL.以抗cd3和抗cd28小鼠为研究对象,研究Bat3缺失对tcr依赖信号转导的影响。我们评估了TCR通路的转导因子,发现两者之间蛋白激酶C或细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化没有显著差异Bat3ckoBat3FL / FL.CD4 T细胞(图3.)。尽管,发现磷脂酶C的磷酸化增加,y783Bat3FL / FL.T细胞,在TCR刺激1小时后这种短暂的磷酸化增加并没有持续。因为Akt/mTOR通路是小鼠CD4的关键驱动因子+T细胞分化,我们评估并发现Akt S473磷酸化显著升高Bat3cko抗cd3 /CD28共刺激后的T细胞(图3.)。相比之下,我们没有检测到AKT T308磷酸化的显着差异Bat3ckoBat3FL / FL.CD4 T细胞,提示磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) -PDK1(丙酮酸脱氢酶激酶1)活化不受Bat3缺乏的影响。PI3K和PDK1 S241的磷酸化水平差异不大。我们还检测到了70S6K磷酸化水平的轻微升高,这表明Bat3的缺失可能只会影响PI3K-PDK1通路下游的激酶活性,这可能是由于Akt激活的增加(图3.)。虽然可能存在响应TCR激活的微妙变化,但BAT3缺陷优先增强Akt激酶活性,而不会显着影响TCR活化的其他下游介质。

图3. Bat3缺失导致Akt在S473位点磷酸化增加。

总CD4 T细胞来自Bat3FL / FL.Bat3cko用平板结合的抗cd3和抗cd28抗体激活小鼠2天。之后细胞休息2天。隔夜血清饥饿后,用抗cd3和抗cd28抗体刺激细胞,以确定时间点。制备全细胞裂解液,Western blot分析TCR和mTOR信号通路。结果代表了至少三个独立的实验。

因为mTORC2是Akt S473磷酸化的主要调控因子(20.),我们分析了磷酸盐,发现了Bat3cko在抗CD3和抗CD28刺激后,CD4 T细胞在MTOR S2481中具有增加的磷酸化(图3.)。这些数据在一起表明BAT3的功能优先参与通过MTORC2调节MTOR-AKT信号轴。

BAT3与Rictor互动以调节MTORC2功能

虽然MTOR(猛禽)的调节相关蛋白仅在MTOR复合物1(MTORC1)中发现,但雷帕霉素(RICTOR)的哺乳动物靶标催化剂的雷帕霉素不敏感伴侣特异性结合MTORC2(21.)。为了了解Bat3调控mTORC2活性的分子机制,我们使用针对Rictor、Raptor和mTOR的抗体,从EL4 T细胞淋巴瘤的全细胞裂解液中进行了Bat3共免疫沉淀(co-IPs)。我们发现Bat3被抗rictor抗体优先免疫沉淀,而不是抗raptor抗体,提示Bat3可能与mTORC2复合物相关(图4A)。Bat3-Rictor相互作用的这一重要发现在初级TH1个带有BAT3的细胞CKO.T细胞作为对照(图S6a)。随着MTOR激酶活性所需的与RUCTOR的相互作用,RICTOR与MTOR的调节将是控制MTORC2活性的重要机制(22.,23.)。为了调查BAT3是否可能在本规定中发挥作用,我们检查了MTOR和RICTOR在BAT3的存在或不存在中的相互作用。我们首先建立了用BAT3表达逆转录病毒(BAT3-RV),空载体(GFP-RV),表达BAT3-SHRNA表达的RV(BAT3-SH-RV)和空载体(CTRL-SH)将四种细胞系转换EL4细胞-RV)分别(图S6B)。然后,我们用来自四个建立的EL4细胞系的细胞裂解物进行抗MTOR CO-IP,以检查MTOR-RICTOR相互作用。我们发现EL4细胞中BAT3的过度表达降低了与Rictor的MTOR与Rictor相比的相互作用,与WT水平的BAT3相比(图4B.)。相反,当BAT3表达被击倒时,Rictor-mtor相互作用增加(图4B.)。因此,MTOR和RICTOR之间的相互作用可以根据细胞内BAT3可用性进行扰动,表明BAT3和RUCTOR之间的相互作用可以代表MTORC2功能的先前未识别的调节机制。

图4. Bat3与Rictor相互作用,调节mTORC2功能。

(一个)使用抗体,猛杆,MTOR和同种型兔免疫球蛋白G(IgG)的抗体,在CO-IP中使用等浓度的EL4细胞裂解物。通过Western印迹分析蛋白质样品以检查BAT3的信号。IB,免疫印迹。(B)通过用BAT3表达逆转录病毒(BAT3-RV),空载体(GFP-RV),表达BAT3-SH RNA的RV(BAT3-SH-RV)和空载体(CTRL)来制备全细胞裂解物-SH-RV)分别。将细胞裂解物分别与抗MTOR抗体(AB)一起孵育,以免疫沉淀MTOR复合物,以检查共沉淀的RICTOR的信号。

Bat3抑制hsc70介导的mTORC2激活

Bat3以其作为核苷酸交换因子与Hsc70/Hsp70相互作用而著称(24.)。Bat3与Hsc70的相互作用促进了5 ' -二磷酸腺苷和Hsc70底物的释放(25.)。最近发现HSC70直接绑定Rictor以方便Rictor-MTOR相互作用和MTORC2功能。没有HSC70稳定MTORC2复合物并衰减AKT S473磷酸化(22.)。因此,我们研究了Hsc70在mTORC2功能调节中的作用。通过anti-Rictor和anti-mTOR co-IP,我们证实了Rictor和Hsc70之间的相互作用,而mTOR和Hsc70之间没有相互作用。这种相互作用可以通过添加1mm 5 ' -三磷酸腺苷(ATP)来抑制(图5A)。此外,我们发现,如中检测到的,在没有Bat3的情况下,Rictor-Hsc70相互作用显著增加Bat3ckoT细胞。在没有Bat3的情况下,我们可以检测到Hsc70- mtor相互作用,这可能是在没有Bat3的情况下,Hsc70与Rictor结合增强所介导的间接相互作用(图5A)。这表明BAT3可以限制HSC70至MTORC2的访问,从而使该蛋白质复合物稳定。

图5. Bat3抑制hsc70介导的mTORC2激活。

(一个)CD4 T细胞来自Bat3FL / FL.Bat3cko平板结合抗cd3和抗cd28抗体激活小鼠2天。细胞休息2 ~ 3天,制备抗rictor和抗mtor co-IP的全细胞裂解物。当使用anti-Rictor co-IP时,对照样品中加入1mm腺苷5’-三磷酸(ATP),以触发Hsc70的腺苷三磷酸酶(ATPase)活性。Western blot分析洗脱后的蛋白样品,以确定Hsc70与mTORC2复合物的结合。(B)Bat3FL / FL.Bat3cko制备CD4 T细胞全细胞裂解物,用于抗标枪或同种型IgG CO-IP,或者没有表明剂量的HSC70。进行免疫印迹以分析MTOR S2481(顶部)的磷酸化,并通过抗标rictor(底部)共沉淀的总MTOR。(C)如(b)中所述进行的CO-IP实验,并通过Western印迹分析MTORC2复合物S473的AKT磷酸化。

为了研究Bat3缺失的功能结果,我们进行了anti-Rictor co-IP实验,并比较了mTOR S2481位点的磷酸化情况,该位点是WT和WT之间mTOR自激活的指标Bat3ckoT细胞。我们证明,在没有BAT3的情况下,抗RICTOR CO-IP的MTOR和RICTOR之间存在更大的相互作用。该结果符合BAT3敲低CD4 T细胞中MTOR-RICTOR相互作用的增加(图4B.)。进一步添加外源性Hsc70可以将WT CD4 T细胞衍生细胞裂解液中的mTOR-Rictor相互作用增强到与中Bat3ckoCD4 T细胞衍生的细胞裂解物(图5B.)。这种增强的MTOR与RUCTOR结合也与MTOR S2481的磷酸化增加相关。结果表明Bat3ckoCD4 T细胞具有比WT CD4 T细胞更多的活性MTOR功能。外源HSC70可以覆盖BAT3的负调节效果。我们的研究结果表明,该升高的MTOR-RICTOR相互作用可能是由于在没有BAT3的情况下增强了与MTORC2复合物的HSC70结合。我们进一步通过将重组AKT与抗RICTOR CO-IP纯化的重组AKT加入MTORC2复合物进行体外激酶测定。结果表明,当将重组AKT与BAT3 - 足够的MTORC2复合物一起孵育重组Akt时,培养重组AKT时,AKT S473磷酸化水平较高。添加外源重组HSC70增加AKT S473磷酸化(图5C.)。我们的数据在一起表明BAT3通过限制HSC2在MTORC2激活中的作用,作为MTORC2复合体的负调节器。

蝙蝠3调节FoxO1-Blimp-1的活性

bat3缺陷T细胞的一个关键表型是Tim-3表达增加。我们和其他人最近已经证明,在肿瘤中功能失调的CD8 T细胞中,Blimp-1是驱动Tim-3和共抑制分子模块表达的关键转录因子(14.,26.)。了解Tim-3在Bat3cko伴随着发育功能障碍表型的发展Bat3ckoT细胞,我们评估了Blimp-1 (PRDM1)。我们发现PRDM1Bat3ckoT细胞与WT控件相比(图6A),这是通过免疫印迹的蛋白质水平确认(图6B.)。与Blimp-1相比,FoxO1促进内存T细胞,但抑制效应T细胞分化(27.),据报道已予以压制PRDM1通过诱导Bcl6 (28.)。

图6. 蝙蝠3调节FoxO1-Blimp-1的活性。

天真的Bat3FL / FL.Bat3ckoCD4.+将T细胞分化为tH1细胞。(一个)QPCR确定成绩单PRDM1,BCL6.,TBX213天后。(B制备全细胞裂解物(WCLS)用于Western印迹以检测Blimp-1表达。(C)用抗CD3 / CD28活化细胞2天,然后休息2天。在过夜血清饥饿后,用抗CD3 / CD28刺激细胞,用于指示时间点。为PfoxO1 S256制备和免疫印迹WCL。(D) 4个ChIP-PCR引物组用于确认FoxO1与Blimp-1位点的结合。(E)天真CD4+用抗CD3 / CD28激活T细胞1天并用对照逆转录(GFP-RV.)或blimp -1表达向量(Prdm1-RV)。3 d后检测Tim-3表达情况。(F) 幼稚的PRDM1FL / FL.PRDM1FL / FL.CKO.CD4.+T细胞在TH0, TH1条件与抗cd3 /CD28。72小时后检测Tim-3表达。(G)CD4+来自Bat3cko×2d2.,Bat3FL / FL.×PRDM1FL / FL.CKO.×2d2.,Bat3FL / FL.×PRDM1FL / FL.dko×2d2.小鼠分化为T细胞H转染C57BL/6受体小鼠。每天监测疾病进展情况;平均疾病评分如图所示。结果代表了至少两个独立的实验。误差条表示平均值±SEM (* .P= 0.01,未配对双尾t测试)。

因为Akt(在Bat3cko T细胞中增强;图3.)在FoxO1细胞分布和转录功能的调控中起着关键作用,因此我们决定研究Bat3对FoxO1的调控作用。我们首先用anti-CD3/anti-CD28刺激体外培养的WT和Bat3cko CD4 T细胞,发现FoxO1 S256磷酸化增加Bat3ckoT细胞(图6C.)。该结果符合所观察到的AKT活动增加Bat3ckoT细胞(图3.)。接下来,我们制备核和细胞质蛋白Bat3FL / FL.Bat3cko抗cd3和抗cd28刺激2小时后的CD4 T细胞。Western blot结果显示,FoxO1蛋白(核质结合)总量与FoxO1蛋白含量相近Bat3FL / FL.和蝙蝠3cko细胞。但是,当比较蛋白质亚细胞分布时,我们发现核福克索1更大Bat3cko细胞比wt在wt中Bat3FL / FL.FoxO1磷酸化水平的升高影响了蛋白在细胞中的分布(图S7A)。

FoxO1的核定位减少表明转录抑制减弱。因此,为了探讨Foxo1在Blimp-1转录中的可能调控作用,我们分析了Foxo1染色质免疫沉淀(ChIP)测序数据(GSE60470) (29.)并确定直接FOXO1与之结合PRDM1基因座(图S7B),包括近端启动子区域中的一个结合位点,通过芯片定量聚合酶链反应(QPCR)证实图6D.)。确认直接抑制转录启动PRDM1通过FOXO1,我们产生了Blimp-1启动子荧光素酶报告构建体。COT转化的PRDM1- 用报道者报告者构建FoxO1表达质粒抑制了PRDM1启动子驱动的荧光素酶表达(图S7C)。

最后,为了研究增加Blimp-1的表达是否有助于bat3缺陷T细胞的表型,我们在naïve CD4 T细胞中进行了逆转录病毒过表达Blimp-1,这导致了Tim-3的表达增强(图6E.)。相反,与我们以前的结果一致(14.),比较Tim-3之间的表达PRDM1FL / FL.×CD4-CRE.WT(PRDM1FL / FL.)CD4 T细胞证明Blimp-1缺陷细胞表达比WT细胞更少的TIM-3(图6F.)。

集体,我们的数据表明FOXO1转录功能由MTORC2路径调节。没有BAT3结果增加MTORC2 / AKT活性,随后增加FOXO1磷酸化并重新分布FOXO1至细胞质。因此,其对Blimp-1的转录抑制是衰减的。增加的Blimp-1表达有助于增加TIM-3表达,TH1细胞终末分化和功能障碍Bat3ckoCD4(T.H1)细胞(所示图8)。

为了验证这一假设,我们生成了Bat3FL / FL.×PRDM1FL / FL.CKO.(Bat3×prdm1dko.)×2d2用分化2D2 T进行被动EAE诱导H1与对照组细胞一起衍生自这些小鼠的1个细胞Bat3FL / FL.×PRDM1FL / FL.×2d2.Bat3cko×2d2.老鼠。结果表明,BAT3缺陷型T细胞中Blimp-1的复杂能够拯救转移的2D2细胞的脑生成潜力(图6G.)。我们还执行了一种收养的T细胞转移模型,由此Bat3FL / FL.,Bat3cko,Prdm1cko,Bat3×prdm1dko.第0天免疫MOG35-55肽。在第8天,收获脾脏和淋巴结,并在沼泽的存在下扩展+il - 12+anti-IL-4。收获后第3天,分离CD4+T细胞注射到C57BL/6受体小鼠中。使用这种实验设置,我们在接受Blimp-1缺陷T细胞的动物身上观察到明显恶化的疾病,并且Blimp-1在bat3缺陷T细胞中共缺失可以挽救它们的脑炎潜能(图S7D)。总之,这些EAE数据支持了Blimp-1转录功能下游的Bat3/mTORC2/Akt通路在T的调控中的关键作用H1细胞终末分化及功能障碍。

BAT3缺乏促进T细胞中的疲劳/功能失调型材

到目前为止,我们的数据表明mTORC2/Akt/Blimp-1通路未受抑制Bat3ckoT细胞驱动H1细胞终末分化和衰竭。从我们早期的EAE研究(图1,F和G),我们能够证明Tim-3是该途径下游的关键效应分子。为了更深入地了解TiM-3和BAT3途径在T细胞功能调节中的作用,我们进行了全基因组RNA测序(RNA-SEQ)分析Bat3- 和Tim-3缺乏CNS-infiltrating TH接受EAE的小鼠的1个细胞。我们发现很多基因受到Tim-3和Bat3的相互调控(Bat3KO中增加了157个基因,Tim-3KO中增加了132个基因;图7A和表S1),与我们之前的结果一致,即BAT3是TIM-3的负调节器(图。1F.)(11.)。分析BAT3和TIM-3缺陷T的DE基因H1个细胞证明基因上调Bat3cko细胞与我们在TILs中描述的功能失调非激活模块(P= 0.0002)(图7,B和C)(15.)。功能障碍_Not_activation模块与肿瘤微环境中的T细胞耗尽以及上调的基因相关联Tim-3cko.T细胞与这个模块无关(P= 0.31)。进一步的分析显示上调基因Bat3ckoT细胞富集在基因签名中,从额外的Anergy研究中产生的数据(30.), 宽容 (31.,32.)和dysfunction_not_activation (15.),但不是直接与CD8激活相关联的签名(32.,33.)CD8 T细胞的效应细胞功能(图7C.)(33.,34.)。这可能部分是因为在Bat3ckoT细胞。我们(14.)及其他(26.,35.先前已经表明,Blimp-1是推动耗尽的T细胞中的卷积基因的整个模块的表达的关键转录因子,并且其他研究表明,Blimp-1可以用作关键转录调节器平衡效应CD8 T细胞用T细胞耗尽功能,从而高精度-1表达提示朝向T细胞耗尽/功能障碍的平衡。我们调查了上调的基因吗?Bat3ckoT细胞被富集为Blimp-1信号。我们发现基因在Bat3cko,与……相比Tim-3cko.对于Blimp-1的靶标显着富集,包括Culiphibition Tim-3,Tigit(与IG和ITIM域)的TIGIT(T细胞免疫感受器)和LAG-3以及IL-10(上升和/或下调PRDM1KO;P<10-17)。对于与BAT3KO相比,在TIM-3KO中调节的基因并不是真的(P= 0.20)(图7D)。我们之前将IL-27鉴定为负责驱动癌症中检查点分子模块的表达的关键细胞因子,部分通过Blimp-1。使用316 CD4的单细胞RNA-SEQ(SCRNA-SEQ)数据集+来自B16F10黑色素瘤的T细胞,我们定义了三个集群,确定为调节性T (T注册)(0),功能失调的CD4(1),以及类似于(2)的naïve。作为参考,我们将IL-27共抑制基因模块的签名投射到这个scRNA-seq数据上,签名突出显示了集群0 (T海军学校规则)和2(功能障碍)CD4(2)(图7e.)。基因信号的投射在Bat3ckoTH1个细胞不仅重叠IL-27,还重叠,但慢性病毒感染签名交叉于IL-27(图7e.)。这Bat3cko此外,在T细胞无反应的其他几种状态(包括能量缺失和耐受)之间的重叠方面,signature得分也很高(图S8)。总之,我们的研究结果表明,Bat3在自身免疫疾病背景下的naïve效应T细胞对记忆T细胞反应中有调节作用,并且Bat3的丢失通过Akt/mTOR/Blimp-1轴促进T细胞功能障碍。

图7. Bat3缺乏促进T细胞衰竭/功能失调。

Naïve CD4 T细胞从Bat3cko×2d2.Tim-3cko.×2d2.并在体外分化为T细胞H1个细胞;4×10.6转染C57BL/6受体小鼠诱导EAE。(一个)基因表达Tim-3cko.BAT3CKO 2D2细胞(VA3.2.+Vb11+)从疾病高峰时(第14天)的中枢神经系统中分离出来。DE基因(289)显示为热图。(B)丰富了文学中不同的签名Bat3cko相对Tim-3cko.细胞,用GSEA预排序分析。已调整的选定签名P< 0.05显示,签名的参考文献用斜体编号。(C用于一些签名的描述性前沿图。NES,正常化的浓缩分数。(D) Prdm1cko和Bat3cko CD4 T细胞之间选择重叠基因的图形表示。(E)t- 嵌入的随机邻居嵌入(t-SNE)图+从携带B16F10黑色素瘤的WT小鼠(14.),由相对签名分数彩色Bat3cko相对Tim-3cko.模块(36个基因;表S2)和IL-27 TIL签名(14.)。

讨论

TIM-3作为效应T中检查点抑制剂的功能H1细胞和CD8 T细胞已被很好地描述(36.)。Tim-3的细胞质尾部可能与含有SH2结构域的蛋白如Fyn, PI3K适配器p85 (37.)和淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK) (11.),并且这种潜在的信号传导可以通过细胞质蛋白BAT3进一步调节,以禁止过早的TIM-3抑制信号转导(11.,38.)。BAT3是一种泛素状的蛋白质,具有各种细胞内生物学功能(1,2,5);然而,我们的研究在诱导T细胞功能障碍中,以前通过调节TIM-3信号传导(11.)。

我们之前研究的同基因4T1和CT26小鼠肿瘤模型特征为功能失调Tim-3+PD-1+til产生的IFN-γ和TNF-α量远低于Tim-3-PD-1+tils。这些tim-3+PD-1+TILs表达量降低50%Bat3mRNA相对于TIM-3-PD-1+细胞。同样,我们也发现了Bat3TIM-3的mRNA表达显着降低+PD-1+- authed cd4.+相对于TIM-3,从未治疗的HIV-1感染个体分离的细胞-PD-1+CD4.+T细胞(11.)。这一观察表明,Bat3表达的减少与癌症和慢性HIV感染中的T细胞功能障碍有关。在本研究中,我们进一步证实了Bat3在2D2 T中的表达缺失H1细胞导致耗尽样表型的发展,包括Tim-3, PD-1和IL-10的表达增加,但IFN-γ和TNF-α的产生减少。总之,这些变化导致了脑源性T的致病性减弱H1细胞。我们的研究表明,在效应T细胞分化期间,BAT3在MTORC2-AKT-BLIMP-1通路调节中发挥关键作用。这种效果足以使得即使在高炎症自身免疫神经炎症下,即使在高炎症自身免疫神经炎症下也能诱导效应T细胞的功能障碍表型。在多发性硬化症(MS)的患者中,而髓鞘特异性CD4+Tim-3+良性MS (BEMS)患者的CD4+Bat3+初级渐进式ms(ppms)增加t细胞(40)。封闭的Galectin-9-TIM-3相互作用反转TIM-3介导的抑制在BEMS中,复发 - 剩余的MS和健康对照组,但不在BAT3表达高的PPMS组中。总的来说,这些数据表明,Tim-3和BAT3相当控制人类中T细胞的脑生成表型。

在这里,我们证明了T细胞的BAT3缺乏导致效应T的深刻缺陷H1鼠EAE模型中的1个细胞分化。表型,BAT3缺陷H1细胞表现出效应功能受损和早期收缩。相反,T细胞中Tim-3的缺乏会加剧EAE的诱导。TIM-3BAT3DKO在很大程度上挽救了T细胞中Bat3缺失的表型缺陷H1细胞分化,包括IFN-γ产生,CNS渗透效应器的频率H1个细胞(CD44+;KLRG1+), IL-7R+细胞。然而,IL-2的产生TIM-3BAT3DKO与WT相比,小鼠的T细胞含量仍然较低。这一结果表明,除了调控Tim-3信号通路外,Bat3可能在效应T的调控中发挥了微妙的作用H1细胞。

作为生长和细胞代谢的中枢调节因子,MTOR在T细胞分化和效应/记忆分化中起着关键作用(21.)。MTOR存在于两种多曲线复合物中,MTORC1和MTORC2。虽然猛禽仅在MTORC1中找到,但Rictor专门绑定到MTORC2(21.)。mTORC1调控的分子机制已经被广泛研究,但对mTORC2调控的认识仍然有限(40)。在这里,我们展示了一个以前未确定的机制,即Bat3限制hsc70依赖的mTORC2激活。与此相一致,我们发现缺乏bat3的T细胞优先增加mTORC2的功能和下游Akt激酶的活性。最近的一项研究表明Tim-3信号通路在髓细胞中PI3K激酶通路的激活中具有潜在的作用(41.)。因此,Tim-3表达可能会促进终端T.H1通过增强MTORC1途径来差异化。因此,BAT3缺陷通过无限制的MTORC2直接加快末端分化和耗尽(I),该无限制的MTORC2通过在TIM-3下游信令上间接通过损失AKT信号传导和(ii),从而促进MTORC1活动。

在我们的研究的基础上,我们提出了下列模型,以便在T细胞末端分化和耗尽中的BAT3的作用。BAT3结合RUCTOR,从而通过HSC70依赖性机制抑制MTORC2活性。在效应器T细胞末端分化和耗尽期间,减少了BAT3的表达。因此,提高了TIM-3信令。同时,也被激活MTORC2功能,随后通过磷酸化FOXO1激活AKT激酶并诱导高水平的Blimp-1表达,从而将其从细胞核中排除。CIT-3的表达增加将进一步激活PI3K-PDK1途径以在AKT上磷酸化T308(41.),从而完全激活AKT激酶和下游事件(图8)。这种监管循环最终将抑制TH1细胞介导的免疫反应。因此,Tim-3在Bat3ckoT细胞可以提供正反馈回路并进一步强化Akt功能,增强末端效应器T细胞分化和耗尽。AKT信号传导调节编码T细胞因子1(TCF1),IL-7Rα,CC-趋化因子受体7(CCR7)和L-SELETIN,对茎茎/记忆T细胞分化至关重要的分子的基因的表达(42.,43.)。先前已提出,强制表达TIM-3导致产生短效应的效应T细胞反应,增加AKT / MTOR活性(44.)。然而,在该系统中,没有评估BAT3的表达,并且我们建议对这些发现的谨慎解释,因为长期的寿命的记忆细胞生成可能是由于在该过表达模型中通过TIM-3增加了BAT3的封存。在同样的论文中,作者描述了TIM-3中的减少的AKT / MTOR信号传导−−/老鼠。这可以通过Bat3的可用性来解释,这与我们观察到的Bat3与mTORC2复杂地层的Rictor可用性相互作用和限制相一致。进一步支持这一发现,我们观察到PI3K/Akt/mTOR活性增加Bat3ckoT细胞。

图8 图形概要。

BAT3介导的MTORC2-AKT-BLIMP-1-TIM-3途径调节在T细胞末端分化和耗尽中的模型。

增加的AKT活动Bat3cko细胞导致升高的pfoxO1,其先前已被证明调节TCF1的表达(TCF7.)。已显示TCF1在效应CD8 T细胞的末端分化中发挥重要作用,并且FOXO1驱动的TCF1与增加的T细胞茎,效应和增加的记忆表型增加相关(45.,46.)。TCF1之间存在拮抗作用,其在CD4和CD8 T细胞中促进茎和TIM-3表达。已经表明,Tim-3的高表达与TCF7.Tim-3的低表达常用于鉴定体内TCF1高表达群体(47.)。我们预测,BAT3的损失(无限制的TIM-3)不仅促进了终端效应的产生,还促进了在T细胞膨胀期间诱导耗尽和反对茎。BAT3可以介导这种效果的潜在机制部分地解释了所做的观察BAT3CKO.形成“耗尽” - 静量表型的小鼠以及BAT3的损失促进了效应T细胞的收缩。以前的研究表明,TCF1可以转移本身并促进进料前循环中的自我表达(48.)。TIM-3和TCF1的互惠关系可能导致一个人假设激活TIM-3可能在直接调节方面发挥关键作用TCF7.表达式。但是,这仍然是在实验确定的。

作为控制THBlimp-1直接调控Tim-3、IL-10、KLRG1等效应分子,同时抑制IL-7R (CD127)和IL-2的表达。虽然T细胞衰竭在慢性病毒感染和癌症中与预后不良有关,但在自身免疫的背景下,T细胞衰竭实际上与许多自身免疫疾病的长期临床结果有关,包括炎症性肠病、1型糖尿病和银屑病(49.)。我们假设通过致病自身免疫细胞采集疲惫的表型可能是对有问题的组织造成损害的保护机制。复发率和对自身免疫治疗的反应已被证明与检查点分子的表达和T细胞耗尽的发育直接相关(49.)。我们的研究表明,即使在促炎自身免疫设置下,BAT3也可能是T细胞疲惫的临界调节剂。

在我们的研究中,我们发现缺乏bat3的T细胞水平升高PRDM1并且那个上调的基因Bat3ckoT细胞显着富集PRDM1和耗竭基因签名,包括与Il10一起表达的共抑制分子模块。最近,我们已经确定IL-27是一种关键的细胞因子,它可以部分通过Blimp-1驱动癌症检查点分子模块的表达。我们也观察到在Bat3ckoT细胞,我们有兴趣了解IL-27信令和MTORC2-AKT路径中是否存在重叠的基因表达模式,在T的调节中存在H自身免疫期间1个细胞功能障碍。我们的数据表明,Blimp-1是链接这两个网络的关键节点,并且可以部分地负责在BAT3CKO小鼠中观察到的组织炎症和自身免疫。

我们的研究提出了促进T细胞耗尽的方法是否可以积极利用以改变自身免疫性疾病的过程的重要问题。我们的研究表明,对促炎症疾病中T细胞耗尽的过程的理解也可能提前患有自身免疫的疗法,因为T细胞耗尽的原则已被利用治疗癌症。

材料和方法

老鼠

C57BL / 6小鼠购自杰克逊实验室。Tim-3FL / FL.老鼠和Bat3FL / FL.如补充材料中所述产生小鼠。PRDM1FL / FL.小鼠从杰克逊实验室获得。Tim-3cko.,Bat3cko,Prdm1cko,Tim-3×Bat3dko,Bat3×prdm1dko.老鼠是通过繁殖而产生的CD4-CRE.来自杰克逊实验室的TG小鼠。此外,Tim-3cko.,Bat3cko,Tim-3×Bat3dko,Bat3×prdm1dko.小鼠再与2D2小鼠交配(室内繁殖)。动物实验是按照布里格姆妇女医院和哈佛医学院动物护理和使用委员会的指导方针进行的。

积极和被动的EAE归纳

对于活性EAE诱导,将6至8周龄的小鼠皮下免疫,用100μg的玉米皮35-55肽(Mevgwyrspfsrvvhlyrngk; QCB Biosource International)在CFA [用MTB(热杀死结核分枝杆菌)提取H37-Ra (5 mg/ml;Difco)]。小鼠在第0天和第2天腹腔注射150 ng的百日咳毒素(生物实验室列表)。被动EAE诱导,4 × 1062D2 T.H来自不同突变小鼠的1个细胞静脉内转移至C57BL / 6受体。每天监测小鼠,用于开发EAE并使用以下标准进行评分:0,无疾病;1,尾气减少;2,后肢弱点或部分瘫痪;3,完全后肢瘫痪;4,正面和后肢瘫痪;或5,垂死的国家。在指示的时间点安乐死小鼠。所有小鼠均采用特定的无病原体动物设施。哈佛医疗区域动物常务委员会审查和批准了所有繁殖和实验,并根据美国国家卫生机构进行使用,以使用现场动物。

抗体和细胞因子

从BioLegend:抗CD62(克隆MEL-14),抗IL-10(克隆JES5-16E3),抗TNF(克隆TN3-19.12),抗IL-2(克隆JES6-5H4),抗IFN-γ(克隆XMG1.2),LAG3(克隆C9B7W),CD127,CD44,KLRG1,VA3.2和VB11。在房屋中制备APC(联素胶质蛋白) - 蒂米-3(5D12)。蛋白质印迹的所有主要抗体购自电池信号技术。所有IRDYE二抗用于检测Li-Cor Odyssey成像系统中的一抗体信号的所有IRDYE二抗都购自Li-Cor Biotechnology。用于T细胞的所有重组小鼠细胞因子在体外培养和TIM-3诱导中购自R&D系统。

细胞分离和培养

总CD4.+来自不同小鼠系的T细胞首先通过CD4阳性选择富集+T细胞分离试剂来自默天尼生物科技公司。细胞用cd25 -荧光素异硫氰酸酯、CD44-PE(藻红蛋白)和CD62L-APC染色。天真的CD4+(CD4+CD44-CD62L+通过BD Facsaria(BD Biosciences)分选T细胞。然后用板式抗CD3(1μg/ mL; 145-2C11)和抗CD28(1μg/ ml; PV-1)(两者在内部制成),将分选的Naïvet细胞活化2天。对于T.H1条件下,在IL-12 (10 ng/ml)和anti-IL-4 (10 μg/ml)存在下培养细胞。

逆转录病毒转导

将Blimp-1和GFP对照的逆转录病毒表达质粒包装在293T细胞中,用于转导小鼠naïve CD4+T细胞被板结合的抗cd3和抗cd28抗体激活。

免疫印迹

收集细胞,用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,中浓度的裂解缓冲液裂解30分钟。裂解液以13000 rpm离心,收集上清液,用Pierce法测定蛋白浓度。样品在1× SDS上样缓冲液中稀释,在还原条件下煮沸5 min,然后在10% SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶上分离。将凝胶转移到硝化纤维素膜上,用三缓冲盐水+ 0.1% Tween 20和3%牛血清白蛋白(BSA)或牛奶封闭,并用指示的一抗进行检测。采用奥德赛成像系统进行印迹分析。

细胞内细胞因子染色

用于体外实验,NaïveCD4+T细胞被平板结合的抗cd3和抗cd28抗体激活2天。然后细胞休息3天,用平板结合的抗cd3 (0.1 μg/ml)和抗cd28重新刺激24小时,然后在高尔基Stop (BD Biosciences)存在下,分别给予福波12-肉豆蔻酸13-醋酸酯(PMA)和离子霉素(50 ng/ml和1 μM)刺激,用于细胞内细胞因子检测。所有数据收集于LSR II (BD Biosciences)或Calibur (BD Biosciences)上,并使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)进行分析。在体外实验中,如前所述,我们分离了浸润cns的T细胞和引流淋巴结的T细胞(50.)。PMA和离子霉素进一步刺激细胞3小时,随后进行细胞内细胞因子染色。简单地说,用细胞表面标记物包括(v3.2)在冰上染色20分钟+Vb11+)为2D2细胞。用荧光活化细胞分选缓冲液(PBS、0.5% BSA和2 mM EDTA)洗涤细胞,4%多聚甲醛在冰上固定10分钟。然后用BD烫发/水洗细胞,并在冰上用针对指示细胞内细胞因子的抗体染色30分钟。

芯片分析

CD4.+通过CD4纯化来自C57BL / 6小鼠的T细胞+T细胞阴性选择试剂盒(Miltenyi Biotech)在中性条件下(TH0) 2天。细胞休息额外3天,用平板结合的抗cd3和抗cd28 (0.1 μg/ml)重新刺激24小时,然后进行染色质制备,用于ChIP分析。使用SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP Kit (Cell Signaling Technology)进行染色质片断制备和ChIP。Foxo1抗体购自Santa Cruz Biotechnology。

实时PCR分析

用RNEasy Plus套件(QIAGEN)提取RNA,并通过IScript(Bio-rad)制备cDNA。使用Taqman快速先进的主混音(Thermo Fisher Scientific)通过定量实时PCR分析所有基因表达,采用Taqman快速先进的主混音(Thermo Fisher Scientific),采用以下底漆/探头集:PRDM1 MM00476128_M1,TBX21 MM00450960_M1,BCL6 MM00477633_M1,和ActB(应用生物系统)。通过双链QPCR相对于在同一样本中检测到的ACTB来计算表达值。

Nanostring分析

我们分析了CD4中的基因表达+效应T细胞(Tim-3+或tim-3-)在疾病峰(第14天)的MOG免疫禽类小鼠使用定制纳米基因的397个基因的峰值(第14天),代表IL-27驱动基因签名(245基因)和功能失调的CD8+TIL基因签名(245个基因)(14.)。首先基于其对所有样品的相对值调整每个样本来标准化表达值。然后通过从每个样品中减去计算的背景(平均值),通过家务几何平均值进行额外的归一化,其中管家基因被定义为HPRT,GAPDH,ACTIN和TUBB5。识别de基因,Ptim3_阳性和tim - 3_阴性CD4细胞的差异表达值t用Bonferroni-Hochberg方法测试和校正多假设检测(R函数P.Adjust,参数“方法”设置为“BH”)。基因纠正P值小于0.05为DE。

RNA-SEQ分析

Reads与RSEM对齐。TPM(每百万记录)值从计数数据中计算,然后是分位数标准化和日志2改变了。每种情况下生成三个重复样本,但其中一个Bat3cko样本被排除,因为它是一个明确的离群值相对于其他样本。如果基因的平均表达量大于1且方差大于0,则保留基因进行下游分析。在通过这些阈值的10289个基因中,如果基因的平均和中位数表达变化大于2倍,并且每种条件下最大和最小值之间的倍数变化大于1.3,则判定为DE。意义图7B.采用基因集合富集分析(GSEA)预排序分析工具进行评估。基因的排名是基于它们的折叠变化。使用GSEA工具输出的富集图图7C.为了说明签名。在R.中使用Seurat包在tSNE上绘制了316个CD4细胞,污染的人群被过滤掉,并用Seurat的AddModuleScore函数对图进行着色。

补充材料

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章根据创意公共归因 - 非商业许可证,它允许在任何媒介中使用、分发和复制,只要最终的使用是为商业利益,并提供原稿被适当引用。

引用和笔记

致谢:我们感谢M. Collins的深入讨论和J. Xia, H. Stroh, M. Weinstein的实验室支持。资金:T嗨s work was supported by grants from the National Institutes of Health (P01 AI073748, R01NS045937, NS030843, P01NS038037, and P01AI056299 to V.K.), European Commission Excellent Science H2020 (#708658 and #10130984 to K.O.D.), and Career Transitional Fellowship from the National Multiple Sclerosis Society (C.W.).作者捐款:C.Z.和K.O.D.在G.G.,S.X.,S.Z.,M.A.,C.W.,H.Z.,K.G.和E.C.K.N中进行大部分实验。通过来自M.S的指导进行了计算分析。和A.R.O.R.-,H.O.,T.M.和M.R.提供了概念投入和其他基本资源。V.K.和c.z.设计了实验设置并构思了这项研究。C.Z. and K.O.D. wrote the manuscript and prepared figures with conceptual input and edits from V.K. and all authors.利益争夺:他是Tizona Therapeutics和Astellas Global Pharma Development Inc.的科学顾问委员会的成员。V.K.是布里格姆妇女医院(no。WO2011159877A2, 2011年6月16日提交,2011年12月22日发布)。和V.K.是摄氏度治疗公司的联合创始人,并拥有所有权权益。他是摄氏度治疗公司的联合创始人和股东,直到2020年8月31日,他是Syros Pharmaceuticals, Neogene Therapeutics, Asimov和Thermo Fisher Scientific的SAB成员。从2020年8月1日起,A.R.是Genentech的员工。V.K.的利益由布里格姆妇女医院及合作伙伴保健机构根据其利益冲突政策进行审查和管理。根据利益冲突政策,布罗德研究所和HHMI对a.r.的利益进行了审查和管理。作者们宣称他们没有其他的竞争利益。数据和材料可用性:数据已上传至NCBI基因表达Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),注册号为GSE168435。评价论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充资料中。可能要求作者提供与本文相关的其他数据。

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