研究文章 神经科学

NA.+/ ca.2 +交换者介导冷Ca2 +维持温度补偿的昼夜节律信号

查看全部隐藏作者和附属机构

十搏欧洲杯直播官网2021年4月30日:
卷。7,不。18,eabe8132
DOI:10.1126 / sciadv.abe8132

摘要

昼夜节律是基于时钟基因/蛋白质产生的生化振荡,在动物、真菌、植物和蓝藻细菌中独立进化。振荡速度的温度补偿是生物钟的共同特征,但其进化保守机制尚不清楚。这里是Na+/ ca.2 +交换机(NCX)介导冷响应CA2 +哺乳动物细胞中温度补偿振荡的重要信号。为了响应温度下降,NCX提高了细胞内Ca2 +,激活CA2 +/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II并加速时钟基因的转录振荡。冷响应性ca2 +信号在小鼠中是保守的,果蝇, 和拟南芥。哺乳动物细胞节奏和果蝇行为节律受到NCX抑制严重衰减,表明NCX在温度补偿和自主振荡中的基本作用。NCX还有助于Cyanobacterial时钟中的温度补偿转录节奏。我们的结果表明NCX介导的CA2 +信号传导是一种普遍的机制,其潜在的温度补偿昼夜节律,无论是真核生物和原核生物。

介绍

在众多的生物功能中,生物钟因其独特的特性而特别引人关注,即以大约24小时为周期的温度补偿振荡(1)。一般来说,温度每升高10°C,生物化学反应的速度就会加快两到三倍(问:10= 2到3),而问:10时钟的振荡速度为0.8至1.2。该物业最初是温度独立性的,但后来的温度补偿是基于对光合丁基曲素酸盐的温度的影响的过度渗透(Lingulodinium polyedra)(1)。温度补偿是昼夜节奏时钟的共同特性,这意味着补偿的机制与用于细胞自主振荡的机械紧密相关。

大多数明显的昼夜节律是基于时钟基因及其编码的蛋白质所产生的生化振荡(2-5.)。时钟基因的同源性在动物、真菌、植物和蓝藻细菌中是有限的,表明时钟基因是在谱系分化后独立进化的。在蓝藻中,KaiC磷酸化节律构成一个核心昼夜节律振荡器,称为翻译后振荡器(PTO) (5.)。KaiA-KaiB-KaiC蛋白复合物中KaiC的磷酸化节律在体外温度补偿。在真核生物中,时钟基因及其编码蛋白构成转录/翻译反馈回路(TTFLs) (2-4.)。因为在分割时钟中基于TTFL的TTFL(毛茸茸和增强者)是温度敏感的(问:10= 2到3)(6.),温度补偿并不是ttfl固有的一般特性。这表明存在调控ttfl昼夜节律振荡的重要机制。

从历史上看,在发现时钟基因之前,提出了涉及离子和离子调节剂在血浆膜中的反馈系统作为昼夜昼夜振荡机制(7.)。该“膜模型”是基于观察,即昼夜节律尤其受到各种真核生物中的离子浓度或离子调节剂活性的影响(7.)。迄今为止,几个离子,尤其是ca2 +已被证明在哺乳动物中振荡TTFL的振荡发挥重要作用(8.)、昆虫(9.)和植物(10)。在老鼠和果蝇、细胞内钙2 +水平显示出强劲的昼夜节律振荡(11-13),引起Ca的节律性激活2 +/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(Camkii)(14-16)。CaMKII磷酸化CLOCK以激活CLOCK- bmal1异二聚体,这是动物ttfl中的关键转录激活因子(3.)。CA的上游稳压器2 +- 依赖性磷酸化信号是TTFL和膜模型之间的缺失链路。

结果

加利福尼亚州2 +信令是温度补偿振荡的键

为了揭示哺乳动物中参与温度补偿振荡的关键调控因子,我们研究了各种靶向蛋白激酶或离子调节因子的小分子化合物(表S1)对大鼠-1成纤维细胞稳定表达的细胞节律的影响BMAL1.荧光素酶报告(1417)。一种问:10从32°和37°C记录的生物发光节律的周期长度(figs。S1, A, B和S2A)。所有筛选结果均通过Δ进行评价问:10值,它被定义为问:10药物处理细胞与对照[0.1%二甲亚砜(DMSO)处理]细胞之间的数值(图。1A)。我们发现δ的显着增加问:10Camkii抑制剂KN-93(图。1A)以剂量依赖的方式(图1,B和C)。用10μm的kn-93处理在37℃时缩短了周期,而它延长了32°C时的时期(图。1D)。这种温度依赖的KN-93的双向效果在于许多化合物在32°和37℃下显示单向周期改性效果(图S1C)。KN-92,kN-93的非活性模拟对δ没有显着影响问:10价值 (图1E.(图S2B),支持KN-93对CaMKII的特异性作用。

图1 Camkii和NCX活动对于温度补偿至关重要。

一种)化学抑制剂对的影响问:10大鼠1 - 1-的生物发光节奏BMAL1.luc细胞。正常化实验到实验变化,δ问:10与车辆(DMSO)控制相比的值用于比较所有筛选数据。波形和其他参数如图4和图5所示。S1到S3。(B.)大鼠1-的代表性生物发光节奏BMAL1.-luc细胞存在KN-93(左)或KB-R7943(右)32°或37°C。(C) KN-93和KB-R7943的剂量依赖效应问:10。★P.与DMSO比较< 0.05 (Dunnett’s test)。(D.)KN-93,KB-R7943或SEA0400在32°或37°C时的剂量和温度依赖性效果。★P.与DMSO比较< 0.05 (Dunnett’s test)。(E.)KN-92,KN-93或SEA0400对δ的影响问:10价值。我们在第一次筛选(a)中使用的浓度一致为10 μM,其中两种化合物KN-93和KB-R7943符合我们的标准。然后,我们对这两种化合物与几个对照化合物(B ~ E)进行了重复性试验和剂量依赖性试验,并给出了三个独立样品(A和C ~ E)的代表性数据(B)或扫描电镜(SEM)的平均值。

在详细分析这些化合物的作用时,我们注意到Na抑制剂KB-R7943的处理+/ ca.2 +换热器(NCX) (18),增加了问:10以剂量依赖的方式(图1,B和C)。与CaMKII抑制剂类似,KB-R7943对昼夜节律周期表现出温度依赖的双向影响(图。1D)。另一种NCX抑制剂SEA0400 (18),还显示了双向周期改性效果(图。1D)和问:10- 效果(图1E.)。另一方面,l型钙的阻滞剂硝苯地平和维拉帕米治疗大鼠-1细胞后,没有观察到这些作用2 +一种酪蛋白激酶I的延长期抑制剂IC261 (图1,C, D,和图S3) (15)。

在32°和37℃之间的各种温度下进一步分析KN-93和KB-R7943的时期修饰效果(图S4)。作为一种对照,用DMSO处理的大鼠1细胞在较低温度下显示较短的时间(图2A),在各种物种中观察到过度补偿的现象(1-5.)。相比之下,在KN-93或KB-R7943 (图2A),这种时期延长效果特别明显低于35°C(图。2B)。的问:10从32°和35℃的昼夜昼夜节点计算的值为0.89(载体),1.49(20μmkB-R7943),或2.01(10μmKn-93)。显然,通过抑制Camkii或NCX活性,过度复分的振荡变为温度敏感。这些结果一起证明Camkii和NCX是哺乳动物蜂窝时钟中温度补偿的关键球员。

图2 温度补偿由Camkii或NCX抑制剂损害。

一种)大鼠的周期长度-1-BMAL1.-luc细胞在KN-93或Kb-R7943存在下在32°,33°,34°,35°,36°或37℃下。★P.与DMSO相比<0.05(学生T.测试)。(B.)KN-93或KB-R7943在周期长度的温度依赖性效果。显示了来自三个独立样品(A和B)的SEM的手段。

ncx-ca.2 +-CaMKII信号对细胞昼夜节律振荡很重要

注意,大鼠1成纤维细胞的KB-R7943治疗降低了细胞节律的幅度(图。1B)。在靶向离子通道和转运蛋白的化学品中,只有KB-R7943抑制了节奏的相对幅度(图3),表明除了温度补偿外,NCX在细胞自主振荡机制中也发挥了重要作用。

Fig. 3 NCX-dependent Ca2+-CaMKII signaling is a key determinant of the state of circadian oscillator.

(A) Effects of various ion channel modulators on the amplitude of Rat-1–Bmal1-luc cells. Bioluminescence rhythm data are shown in fig. S2. (B) Effects of NCX inhibitors on intracellular Ca2+ levels. The Ca2+ level changes by the drug were measured by using Fluo-4 in NIH3T3 cells. ★P < 0.05 compared to DMSO (Dunnett’s test). (C) Effects of the NCX inhibitors on intracellular CaMKII levels in NIH3T3 cells. After 1-day treatment with the inhibitor or DMSO, phosphorylation activity of the cell lysate was measured with syntide-2. ★P < 0.05 compared to DMSO (Student’s t test). (D) Effects of Ca2+-CaMKII signaling inhibitors on amplitude of the rhythms in Rat-1–Bmal1-luc cells. ★P < 0.05 compared to DMSO (Dunnett’s test). The level of DMSO control was set to 100% (A to D). TFP, trifluoperazine. (E) Reversible effects of NCX inhibitors on bioluminescence rhythm of Rat-1–Bmal1-luc cells or Rat-1–Per2-luc cells. (F) Effects of pulse inhibition of CaMKII or NCX on phase of the oscillator. Two-hour treatment of KN-93 (left) or KB-R7943 (middle) or 1-hour treatment of SEA0400 (right) was applied to Rat-1–Bmal1-luc cells at various circadian time (CT). CT12 was defined as trough level of Bmal1-luc rhythm. Because the treatment of KN-93 at CT24 resulted in the disappearance of the cellular rhythm, the extent of the phase shift was not determined. Data shown are means with SEM from three (A, B, D, and F) or eight (C) independent samples. All experimental data in this figure were obtained from cells cultured at 37°C. nd, not determined.

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">
图3 NCX依赖CA2 +-Camkii信令是昼夜振荡器状态的关键决定因素。

一种)各种离子通道调制器对大鼠1-幅度的影响BMAL1.luc细胞。生物发光节奏数据如图2所示。S2。(B.nCx抑制剂对细胞内Ca的影响2 +水平。加利福尼亚州2 +通过使用NIH3T3细胞中使用氟-4来测量药物的水平变化。★P.与DMSO比较< 0.05 (Dunnett’s test)。(CnCX抑制剂对NIH3T3细胞细胞内Camkii水平的影响。在用抑制剂或DMSO处理1天处理后,用Syntige-2测量细胞裂解物的磷酸化活性。★P.与DMSO相比<0.05(学生T.测试)。(D.) Ca的作用2 +-Camkii信号传导抑制剂在大鼠1-振幅上的节奏幅度BMAL1.luc细胞。★P.与DMSO比较< 0.05 (Dunnett’s test)。DMSO对照设置为100% (A ~ D)。TFP、三氟拉嗪。(E.) NCX抑制剂对大鼠-1 -荧光节律的可逆影响BMAL1.-luc细胞或大鼠1-Per2luc细胞。(F)脉冲抑制CAMKII或NCX对振荡器相位的影响。将kN-93(左)或KB-R7943(中间)或1小时治疗Sea0400(右)治疗的两小时治疗用于大鼠1-BMAL1.-luc细胞在不同的生理时间(CT)。CT12定义为谷水平BMAL1.-luc节奏。因为在CT24处的KN-93的处理导致细胞节律的消失,因此未确定相移的程度。所示的数据具有来自三(A,B,D和F)或八(C)独立样本的SEM。该图中的所有实验数据是从在37℃培养的细胞中获得的。nd,没有确定。

ncx交换3 na+为12 +穿过质膜。NCX是一种独特的胞质钙双向调节因子2 +集中,因为它可以调解CA2 +流入和流出,不仅取决于膜电位,而且取决于Na的局部浓度+和加利福尼亚州2 +18)。响应细胞质CA的增加2 +水平,NCX介导Ca2 +Efflux,而NCX可以保持稳态水平的细胞内Ca2 +通过促进CA.2 +在几种类型的细胞中涌入(18)。我们检查了NCX在细胞内CA调控中的作用2 +NIH3T3成纤维细胞的水平。氟-4乙酰氧基甲基酯(Fluo-4 AM)基于CA2 +成像显示,通过加入5至20μMNCX抑制剂KB-R7943至培养基(以下),培养细胞中的基底荧光水平显着降低(图3 b),表示NCX贡献净Ca2 +静态状态涌入。然后,我们评估了KB-R7943对细胞CAMKII活性的影响,这反映了细胞内CA2 +等级 (14)。用20μm的KB-R7943对NIH3T3细胞的一天处理显着降低了嵌入式-2的CAMKII活性,特定于CAMKII(图3 c)(14)。这些结果揭示了NCX在维持CA活动水平中的重要作用2 +-camkii信号在成纤维细胞中。

解决NCX-Ca的作用2 +-Camkii信号在细胞自主振荡中,我们研究了慢性抑制信号传导对大鼠1报告细胞中的昼夜节律的影响(1417)。检测细胞生物发光节律的相对振幅BMAL1.通过用KN-93,三氟吡啶(钙调蛋白拮抗剂),1,2-双(2-氨基氧基)乙烷 -NNN”,N' - 乙酸(Bapta)-am(细胞内Ca2 +螯合剂),或KB-R7943(图3 d)。还观察到通过KB-R7943或SEA0400进行慢性处理的振幅降低效果Per2-luc报告细胞(图3 e)。通过洗涤含药培养基(含量)逆转转录节律的严重阻尼(图3 e)。另一方面,对大鼠-1 - 2小时进行脉冲治疗BMAL1.- 具有KN-93,KB-R7943或SEA0400的-LUC细胞导致生物发光节奏的相移相移,在昼夜节律(CT)21(CT)21(图3 f)。振幅衰减效应(图3,D, E)和抑制剂的公开相位复位动作(图3 f),表明ncx依赖Ca2 +-CaMKII信号在极限环解释中作为昼夜节律振荡器的状态变量(图S5) (1419)。

降温温度激活NCX-CA2 +-CaMKII信号

在检查温度和细胞节律之间关系的实验中,我们发现通过降低温度降低节律的幅度,特别低于34°C(图4DMSO和图。S6)。在相同的温度范围内,KN-93处理(2至10μm)以剂量依赖的方式引起振幅的更大减小(图4,A, B和图S6)。结果表明,CAMKII活性在低于34°C的温度下补偿TTFL的幅度降低。

Fig. 4 Hypothermic activation of NCX-dependent Ca2+-CaMKII signaling.

(A) Effects of temperature on amplitude of cellular rhythm in Rat-1–Bmal1-luc cells. (B) Temperature- and dose-dependent effects of KN-93 on amplitude of cellular rhythm in Rat-1–Bmal1-luc cells. (C) Hypothermic Ca2+ response in NIH3T3 cells. The mean value at 37°C is set to 100. ★P < 0.05 compared to 37°C (Dunnett’s test). Right panels are representative images of intracellular Ca2+ levels in NIH3T3 cells at 37° or 25°C. (D) KB-R7943 or SEA0400 blocks hypothermic Ca2+ response in NIH3T3 cells. Initial value of each cell at 37°C was set to 100%. ★P < 0.5 × 10−7 compared to DMSO (Student’s t test). The Ca2+ imaging analysis was started from 37°C down to 25°C (C and D). (E) NCX mediates hypothermic CaMKII activation in NIH3T3 cells. The mean value of DMSO at 37°C is set to 100%. ★P < 0.05 (Student’s t test). ns, not significant. (F) Ca2+ ionophore up-regulates clock gene Per1, Per2, and Dec1. Thirty-six hours after the rhythm induction with dexamethasone, 10 μM (final concentration) ionomycin, A23187, or the same volume of DMSO was applied to Rat-1–Bmal1-luc cells. One hour after the treatment, the cells were harvested to detect clock gene mRNA levels. The mean value of pretreatment is set to 100%. ★P < 0.05 compared to DMSO (Student’s t test). (G) Hypothermic response of clock genes in Rat-1–Bmal1-luc cells. (H) NCX and CaMKII mediate hypothermic up-regulation of Per1 and Per2 in Rat-1–Bmal1-luc cells. The mean value at 37°C is set to 100%. ★P < 0.05 and ★★P < 0.005 compared to DMSO-treated cells at 27°C (Student’s t test). The cells were harvested to detect clock gene mRNA levels at indicated time points (G) or 5 days (H) after rhythm induction by dexamethasone. Representative data [panels of (C)] or means with SEM from 3 (A, B, F, and G), 8 (E), 9 (H), or 20 (C and D) independent samples are shown.

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">
图4 依赖ncx的Ca的低温激活2 +-camkii信令。

一种)温度对大鼠细胞节律幅度的影响 -BMAL1.luc细胞。(B.CHR-93对大鼠1- 1 - 1-的CHRES节奏幅度对KN-93的温度和剂量依赖性作用。BMAL1.luc细胞。(CCa)体温过低的2 +NIH3T3细胞中的响应。37°C的平均值设定为100.★P.与37°C(Dunnett的测试)相比<0.05。右图是细胞内Ca的代表性图像2 +在37°或25℃下NIH3T3细胞中的水平。(D.) KB-R7943或SEA0400块低温Ca2 +NIH3T3细胞中的响应。37℃时每个细胞的初始值设定为100%。★P.< 0.5 × 10-7与DMSO(学生的T.测试)。加利福尼亚州2 +成像分析从37°C降至25°C(C和D)。(E.)NCX在NIH3T3细胞中介导低温CAMKII活化。37℃下DMSO的平均值设定为100%。★P.<0.05(学生T.测试)。ns,不重要。(F)加利福尼亚州2 +离子载体上调时钟基因Per1Per2, 和12月。在地塞米松节律诱导36小时后,10 μM(终浓度)离子霉素、A23187或相同体积的DMSO作用于大鼠-1 -BMAL1.luc细胞。治疗后一小时,收获细胞以检测时钟基因mRNA水平。预处理的平均值设定为100%。★P.与DMSO相比<0.05(学生T.测试)。(G)大鼠1 -BMAL1.luc细胞。(H)NCX和Camkii介导体温过低的上调Per1Per2在大鼠1-BMAL1.luc细胞。37°C下的平均值设置为100%。★P.< 0.05和★★P.<0.005与27°C的DMSO处理细胞相比(学生的T.测试)。收集细胞,在地塞米松节律诱导后的指定时间点(G)或5天(H)检测时钟基因mRNA水平。从3个(A, B, F,和G), 8个(E), 9个(H),或20个(C和D)独立样本中显示的代表性数据[(C)面板]或使用SEM的平均值。

注意,体温过低,临床定义为核心体温下降35°C(20.)。我们假设Ca2 +如昆虫和植物细胞的耐寒性机制所报道,可以在哺乳动物细胞中激活信号传导以在哺乳动物细胞中被激活。21)。通过研究细胞内CA来测试此想法2 +培养的成纤维细胞水平。在Fluo-4 AM为基础的CA中2 +成像,将温度降低到37°至25°C显着增加了免费CA2 +NIH3T3细胞的水平(问:10= 0.73) (图4摄氏度)。用SEA0400或KB-R7943 (图4 d)。我们发现,由在27℃培养的细胞中制备的裂解物的Camkii活性高于37℃(问:10= 0.78)(图4 e,DMSO)。此外,在用20μmkB-R7943培养的细胞中抑制Camkii的低温活化(图4 e)。这些结果表明NCX增强了CA2 +响应于哺乳动物细胞的温度降低,流入并激活CAMKII信号。

然后我们检查了细胞内Ca2 +水平影响生物钟基因的表达节奏。Rat-1 -BMAL1.-luc细胞,Ca处理1小时2 +离子载体,离子霉素或A23187的上调转录物Per1Per2, 和12月图4 f),由CaMKII (1416)通过E-Box和/或CRE,响应于CA的DNA顺式元素2 +/循环腺苷一磷酸盐信号(3.)。温度从37°C下降到29°C,许多e -box调节基因的表达水平都会升高,例如Per1Per2Per312月12月rev-erb.α,rev-erb.β,&Cry1图4 g)。此外,E4bp4.,由CA调节2 +-NFAT信号(22),在温度下降也上调(图4 g)。符合在较低温度下的生物发光节律的相对幅度的降低(图4),峰槽比BMAL1.通过降低温度来降低表达节律(图4 g)。我们发现低温上调Per1Per2NCX抑制剂KB-R7943或CaMKII抑制剂KN-93 (图4 h)。这些结果共同表明,温度变化通过NCX-Ca对时钟基因的表达水平有显著影响2 +-camkii信令。

Cold-responsive Ca2 +信号补偿TTFL在较低温度下的减速

1957年,黑斯廷斯和Sweeney(1)假设生物钟的温度补偿是基于温度敏感的周期缩短和周期延长过程的组合。TTFL中的大多数生化反应通过降低温度而减慢(表S2)。在体外实验中,纯化的CaMKII对CLOCK肽(CLOCK的Ser/Pro-rich区域)的激酶活性(15)通过降低温度(问:10= 2.9)(图5)。相反,如上所述(图4 e),通过降低温度来提高培养细胞中的Camkii活性(问:10= 0.78),表明CA2 +内流是在较低温度下加速camkii介导的生物钟进程的一个关键因素。CaMKIIα- t286d的过表达,CaMKIIα的组成活性形式(14),加速振荡速度(缩短时期)并增加幅度BMAL1.- 培养的NIH3T3细胞中的节奏(图5,B和C.)。为了理论上了解实验结果,我们通过使用先前公布的数学模型模拟了依赖磷酸化依赖性激活时钟-BMAL1对基因表达节律的影响(23)。在此模拟的横轴上(图5 d),从先前的实验结果估计的时钟BMA1的标准磷酸化率设定为1(23)。我们发现时钟-BMAL1的磷酸化速率的增加加速了振荡速度(缩短了周期)并增加了幅度BMAL1.信使rna的节奏(图5 d)。这些理论分析和实验数据共同表明冷响应性CA2 +信号传导补偿通过降低温度引起的TTFL的周期延长和幅度降低。考虑到细胞内CA的角色2 +在TTFL的昼夜振荡(图3),其温度补偿(图。124., 和5,a到d),我们提出了TTFL与Ca耦合的振荡模型2 +用于温度补偿昼夜节律的振荡器(图5 e)。然后我们检查了CA的回复2 +振荡器温度变化。细胞内ca的昼夜节律2 +用腺相关病毒介导的gcamp6基因转移(11)。将温度降低到35°至28°C导致细胞内Ca的峰和槽水平的向上移动2 +图5,f和g)CA的周期长度没有显着变化2 +振荡(问:10= 1.02)。这些结果共同表明,昼夜节律Ca2 +振荡器高度响应于温度变化,以维持恒定周期长度的细胞昼夜节律。

图5 温度补偿机制。

一种)温度对纯化Camkii磷酸化活性的影响。通过放射自显影测量大鼠CAMKII对时钟肽的磷酸化活性。20℃下的磷酸化时钟水平设定为100%。(B.) CaMKII过表达对生物发光节律的影响BMAL1.-luc在NiH3T3细胞中。(Ccamkii过表达对细胞节律的周期长度和幅度的影响。★P.< 1.0 × 10-6(学生们T.用Bonferroni校正测试)。(D.时钟-BMAL1激活对周期长度和幅度的数学模拟BMAL1.表达的节奏。(E.)Circadian Ca.2 +在哺乳动物的生物钟中,振荡器调节TTFL产生温度补偿的显性节律。(F)温度对CA的影响2 +SCN中的振荡。(G体温过低增加了大谷和CA的峰值水平2 +SCN中的振荡。通过MRUBBY的荧光水平除以MARUBBY,用于归一化温度对荧光指示剂的影响。代表性数据[(a),(b)和(f)]的顶面板或与来自三(a),四(b和c)或七(f和g)的SEM(a,c和g)的平均值显示了独立的样品。

冷响应磷酸化信号在动植物中是保守的

冷响应性ca2 +在几种生物体中体内研究了信号传导。小鼠的冷暴露至4°C 10分钟显着降低体表的温度(图6A)没有大的核心体温变化(图S7A)。红外热成像显示,耳朵的温度和尾部分别下降12.0°和16.5°C(图6A)。我们发现在4°C的90分钟暴露后,在组织裂解物中的Camkii活性(朝向语法-2)增强1.34倍(耳)和2.25倍(尾)(图6B.)。分析了CaMKII的冷响应黑腹果蝇。飞行头的Camkii活动得到1.57倍(图6B.)当苍蝇(在25℃下保持)暴露于4℃时90分钟。在植物,加州2 +- 依赖蛋白激酶(CDPK)是CA的主要换能器2 +信令(24)。CDPKs的催化结构域与动物CaMKII高度同源,syntide-2是CDPKs的模型底物(24)。酶活性磷酸化语法-2在芽(叶和茎)裂解物中拟南芥蒂利亚纳(在22℃下保持在4°C(4°C)上显着增强(图6B.)。这些结果表明CA的激活2 +- 依赖性磷酸化信号传导是冷响应的保护机制。

图6 冷响应磷酸化信号和植物保守。

一种)正常(23℃)或低温(4℃)小鼠的体温。采用红外热像仪测量体表温度。代表性图像显示在左侧面板。采用腹腔植入式装置测量小鼠体核温度(图S7)。(B.)对耳朵或尾部的唐氏酰胺-2的细胞磷酸化活性的低温活化活化亩肌肉,头D. Melanogaster.或拍摄A. Thaliana.。常温下的磷酸化活性设定为100%。★P.<0.01和★★P.< 1.0 × 10-5与未处理的样本(学生的T.测试)。数据均具有来自三个独立样本(A和B)的SEM。

在真核生物和原核生物中,NCX在生物钟中的作用是保守的

哺乳动物NCXs组成了一个由NCX1、NCX2和NCX3三个成员组成的多基因家族。NCX1在多种组织中广泛表达,而NCX2和NCX3在大脑和肌肉中表达(182526)。先前的研究表明NCX1或NCX2的纯合子敲除会导致致死率(1825)。我们检查了NCX2的车轮运行活动节奏+/-小鼠和NCX2.+/-ncx3.- / -double-mutant老鼠。在持续黑暗的条件下,NCX2+/-和NCX2+/-ncx3.- / -与野生型小鼠相比,小鼠表现出昼夜节律的自由奔跑节律(图7,A, B)。一个双突变鼠标在恒定的黑暗中的开启活动偏移的起点和偏移之间表现出不稳定的协调(图7C.),一种类似于观察到Camkiiαk42R激酶死敲击小鼠的表型(14)。这些结果表明,NCX2和NCX3在维持小鼠中的正常行为节律中起重要作用。

Fig. 7 Conserved roles of Ca2+ signaling in circadian clockwork.

(A) Wheel-running rhythm of NCX mutant mice. LD, light-dark; DD, constant dark.(B) Period length of wheel-running rhythm of the NCX mutant mice. Animal number of wild type (WT), NCX2+/−, or NCX2+/− NCX3−/− is 6, 10, or 7, respectively. ★P < 0.05 compared to WT (Student’s t test). (C) Aberrant pattern of morning and evening activity rhythms in NCX2+/− NCX3−/− mice. (D) Locomotor activity rhythm of calx mutants of D. melanogaster. (E) Relative FFT power of locomotor activity rhythm of calx mutants of D. melanogaster. Animal number of WT, calxA, or calxB is 15, 16, or 14, respectively. ★P < 0.5 × 10−4 compared to WT (Student’s t test). (F) Effect of Ca2+ depletion on gene expression rhythm by CCA1::LUC reporter in A. thaliana. (G) Effect of Ca2+ depletion on period length of gene expression rhythm by CCA1::LUC reporter in A. thaliana. (H) Effect of Ca2+ depletion on Q10 of gene expression rhythm by CCA1::LUC reporter in A. thaliana. The sample number of each group is 20. ★P < 1.0 × 10−7 (Student’s t test). (I) Effect of knockout of yrbG on gene expression rhythm by PkaiBC::luxAB in Synechococcus elongatus PCC 7942 at 25° or 30°C. (J) Effect of knockout of yrbG on period length of gene expression rhythm at 25° or 30°C. ★P < 0.05 and ★★P < 0.0005. (K) Effect of knockout of yrbG on Q10 of gene expression rhythm at 25° or 30°C. *P < 0.005. The sample number of each group is 4 (J and K). Data shown are representative (A, C, D, F, and I) or means with SEM (B, E, G, H, J, and K).

" data-icon-position="" data-hide-link-title="0">
图7 CA的保守角色2 +生物钟信号。

一种)NCX突变小鼠的轮运行节律。LD,浅黑;DD,恒暗。(B.)NCX突变小鼠的轮运行节律的周期长度。野生型(WT),NCX2的动物数量+/-,或者NCX2+/-ncx3.- / -分别为6,10或7。★P.与wt相比<0.05(学生的T.测试)。(C)NCX2中早晚活动节奏的异常模式+/-ncx3.- / -老鼠。(D.)机车活动节奏突变体D. Melanogaster.。(E.)运动活性节奏的相对FFT力量突变体D. Melanogaster.。动物数量,一种,或B.分别为15,16或14。★P.< 0.5 × 10-4与WT(学生的T.测试)。(FCA的效果2 +CCA1 :: Luc报道者基因表达节律耗尽A. Thaliana.。(GCA的效果2 +用CCA1::LUC报告基因表达节律的周期长度A. Thaliana.。(HCA的效果2 +耗尽问:10CCA1::LUC报告基因表达节律A. Thaliana.。每组样本数为20。★P.< 1.0 × 10-7(学生们T.测试)。(一世淘汰的效果YRBG.关于P的基因表达节奏Kaibc.:: luxab.Synechocccus elongatus.PCC 7942在25°或30°C时。(j淘汰的效果YRBG.在25°或30℃下基因表达节律的周期长度。★P.< 0.05和★★P.< 0.0005。(K.淘汰的效果YRBG.问:10基因表达节律在25°或30℃下。*P.< 0.005。每组的样本数为4 (J和K)。所示数据具有代表性(A、C、D、F和I)或SEM的平均值(B、E、G、H、J和K)。

D. Melanogaster.,NCX由单个基因编码,。我们分析了两条不同线条的行为节律突变体,一种缺乏对Na+/ ca.2 +交流电流和B.缺乏钙蛋白表达(27)。两个都一种B.纯合突变体在恒定的黑暗中在25°C下在运动活性中严重减弱了运动活性(图7D)。快速傅里叶变换(FFT)分析显示行为节律的显着降低突变体(图7,D和E),表明Calx在的基本作用果蝇控制行为节奏的时钟。

CA的角色2 +在植物时钟进行了调查A. Thaliana.表达CCA1 :: Luc记者。因为拟南芥有13个ncx基因(28),很难评估NCXS的作用。相反,我们调查了CA的影响2 +生长培养基上的生长培养基上的耗尽。加利福尼亚州2 +在22°C恒定光照条件下的自由运行周期显著缩短(图7 F和G),而在17°C时,缩短周期的效应无法检测到。加利福尼亚州2 +消耗造成了土地的增加问:10值0.80(正常介质中)至0.95(图7h.),表明CA2 +在植物中的较低温度下加速振荡速度需要信号传导。

通过产生缺乏的蓝细菌应变,研究了NCX在原核昼夜钟表中的角色YRBG.,是NCX的细菌同源物(28)。Δ中的昼夜节律YRBG.用p监测菌株Kaibc.:: luxab.记者在恒定光照条件下(图7i.)。我们发现YRBG.缺乏率在30℃下显着缩短了周期长度,而与野生型菌株相比,期间在25℃下延长时段(图7,i和j)。因此,这是问:10生物发光节奏的值通过耗尽从1.19增加到1.49YRBG.图7K.)。这些结果表明NCX依赖的CA2 +信号传导在基于TTFL的真核生明时钟和基于PTO的原核时钟系统中起着保守的作用。

讨论

Circadian TTFL是一个精心制作的系统,驱动各种具有各种相角和振幅的明显节奏。TTFL的振荡速度是温度补偿,但TTFL中的许多生物化学反应通过降低温度减慢(表S2)。本研究表明,当CA时,哺乳动物细胞中TTFL的温度补偿受到损害2 +- 依赖磷酸化信号抑制(图2A)。我们发现NCX-CaMKII活性作为昼夜节律振荡器的状态变量的重要作用(图3,D到F,图S5)。本文的研究和前人的一系列工作证明了钙离子的存在2 +振荡器在昼夜振荡机制中起着基本作用(图5 e)(8.-16)。功能研究清楚地表明了NCX依赖性CA的基本作用2 +生物钟三个重要特性的信号传导,即细胞自主振荡(图3,A到E, 和7.,a至c),温度补偿(图。124., 和5.)和夹带(图3 f)。昼夜节日2 +在缺乏的小鼠中观察到振荡BMAL1.或者Cry1 / Cry21112),觉得CA2 +振荡器是哺乳动物TTFL的上游稳压器。

NCX2和NCX3缺陷对小鼠行为节律调节的影响(图7,A到C)建议参与NA+/ ca.2 +在CA交换活动2 +SCN的动态。以前的研究表明,L型CA2 +通道(LTCC)和电压门控Na+高幅度CA需要通道(VGSC)2 +scn中的节奏(1112)。因为NCX活动受到NA局部浓度的调节+/ ca.2 +和膜势(18),LTCC,VGSC和NCX的合作行动似乎在强大CA的发电机制中发挥重要作用2 +SCN中的振荡。

应该强调的是加利福尼亚州的作用2 +/钙调蛋白依赖的蛋白激酶在昆虫的生物钟中是保守的(9.1316), 菌类 (29)和植物(1024),表明Ca2 +振荡器可能是他们共同祖先的核心计时机制(图8,Eukaryota)。在每个血线分发后,时钟基因的子集应该与CA相关联2 +振荡器。值得注意的是,NCX还需要用于基于pto的蓝藻时钟(图7,i到k)。因为细胞内钙2 +在响应于温度下降(30.), YrbG-mediated Ca2 +信号传导可以在体内调节PTO。保守真核生物,虫胶和古痤疮的NCX(图8)(31)表明NCX依赖温度信令对于改编各种各样的生物对环境至关重要。关于NCX调节的CA的进一步研究2 +助焊剂将为昼夜钟表的起源提供进化洞察力。

图8 古代加利福尼亚州的参与2 +用于温度补偿的昼夜节律的信号传导。

在每种谱系的分歧后,TTFL涉及TTFL的时钟基因独立进化。在动物,真菌和植物中,常见的多官能激酶,如酪蛋白激酶I(CKI),CKII,糖原合酶激酶3(GSK3),或CA2 +- 依赖性激酶(Camk),参与了时钟基因产物的后期调节。在蓝藻中,Kaia / Kaib / Kaic的后翻译振荡器驱动TTFL。NCX是一种高度保守的分子,在三个域名中,是真核生物和原核生物中的普通昼夜考试元素,其原始功能是CA的调节2 +体内平衡。

材料和方法

哺乳动物细胞基因表达节律的实时监测

利用稳定表达的大鼠-1成纤维细胞实时监测哺乳动物细胞的基因表达节律BMAL1.荧光素酶报告(141517)。将成纤维细胞镀在35毫米菜(1.0×106.每盘细胞)并在37℃下培养5%CO2在Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM)培养液中(Sigma-Aldrich,目录号。5796)添加10%胎牛血清(FBS;青霉素(50 U/ml)和链霉素(50 μg/ml)。镀后1天,用0.1 μM地塞米松处理细胞2小时,并用DMEM记录培养基(Sigma-Aldrich,目录号:sigma。D2902)添加10%胎牛血清、葡萄糖(3.5 mg/ml)、青霉素(25 U/ml)、链霉素(25 μg/ml)、荧光素0.1 mM、heps - naoh (pH 7.0) 10mm。在培养皿型生物发光检测器Kronos (ATTO, AB-2500)或LumiCycle (Actimetrics)中连续记录空气中培养的细胞的生物发光信号。为了过表达构成型活性CaMKII,将pcdna3.1 -大鼠CaMKIIα- t286d转染到表达CaMKIIα- t286d的NIH3T3细胞BMAL1.记者1天电镀后1天(0.5×106.每35毫米皿数)(14)。从转染后1天监测来自细胞的生物发光节律(如上所述)。

将原始数据除以7天内记录的平均生物发光信号,用于归一化生物发光水平在盘子间的变化。通过减去24小时中心移动平均值来消除归一化节律的趋势,并用曲线下的面积(任意单位)来计算节律的相对振幅(14)。使用峰值至峰期的平均值和培养细胞的地塞米松治疗后1天计算周期长度。问:10通过以下等式计算值 问: 10 = τ. 1 / τ. 2 10 / T. 2 - T. 1 其中τ1和τ2分别是温度T1和T2的时段。

植物中基因表达节奏的实时监测

生物发光节律的监测A. Thaliana.(生态型哥伦比亚-0)表达CCA1 :: LUC如前所述(32)。在含有10mM KCl的生长培养基上生长植物,0.6mm NH4.3.,0.5毫米H.3.3.,0.75 mm mgso4.,0.015 mm znso4.,0.05 mm mnso4.,0.05 mm feso4., 1.5 mM CaCl2,0.05 mm na2-edta,10 mm nh4.3., 0.8%琼脂(pH 6.3), 22°C, 12小时光照(约80 μmol m-2S.-1)/ 12小时黑暗循环2周。然后,将植物转移到没有CaCl的生长培养基中2。转移后两天,向培养基中加入荧光素(终浓度为0.125mm),并在连续光条件下用光电倍增管测量生物致发光信号。

基因菌基因表达节律的实时监测

一种陷入p的菌株Kaibc.:: luxab.在基因组(ILC 976)上靶向部位(中性位点I)的记者盒具有含有氯霉素抗性基因(ILC 976)的野生型菌株。扰乱YRBG.基因,构建质粒(pil 1000),以沉积上游和下游区域YRBG.Synpcc7942_0242)在PGEM-T易骨架(Promega)中具有庆大霉素抗性基因。δYRBG.通过用pil1000的ILC 976转化产生菌株(ILC 1383)。在没有钙源的情况下在BG-11培养基中生长细胞(250μmcac2)。用光电倍增管在40 μmol/m的连续光照下测定生物发光谱2S)12小时后2天后的条件/ 12小时黑暗循环(33)。

逆转录聚合酶链反应分析

根据制造商的方案,使用Trizol试剂(Invitrogen)由培养的细胞制备总RNA。逆转录聚合酶链反应分析如前所述进行(1417)。

细胞内Ca.2 +成像

对于CA.2 +在培养的细胞中成像,NiH3T3细胞在35毫米菜肴上铺板(1.0×106.每盘细胞)并在37℃下培养5%CO2在培养基中。电镀后的一天,培养基被含有0.04%Pluronic F-127和1.25mM丙烯酸的汉克斯平衡盐溶液(Sigma-Aldrich,目录No.H8264)的成像缓冲液所取代。在37°C加载2μm氟-4AM后一小时,通过荧光显微镜(Olympus,BX51W1)监测电池的荧光强度,配备电子乘积电荷耦合器件数码相机(Hamamatsu Photonics,C9100-13 Imagem)在成像缓冲区中。通过使用蠕动泵(Gilson,Minipuls 3)来灌注缓冲器,用于控制缓冲温度,通过热电耦合连续监测并由双自动温度控制器(Warner,TC-344B)控制。

昼炭加利福尼亚州2 +SCN成像如前所述(11)。简而言之,SCN切片由新生儿小鼠制备(C57BL / 6,5天,雄性和雌性)。加利福尼亚州2 +利用腺相关病毒(adeno-associated virus, Addgene, 50942-AAV1)在人synapin -1启动子控制下表达指示蛋白gcamp6和对照荧光蛋白mRuby。

测量Camkii活动

为了分析培养细胞中的Camkii活性,将NiH3T3细胞镀在100毫米菜(1.0×107.每盘细胞)并在37℃下培养5%CO2在培养基中。电镀后的一天,培养基被含有NCX抑制剂或0.1%DMSO(载体)的记录介质代替,并将细胞在27℃或37℃下培养。培养后的一天,细胞刮刀用2ml取样缓冲液收获细胞[20mM Tris-HCl,5mM EDTA,1mM EGTA,10mM焦磷酸钠,50mM NA,1mM NA3.vo.4., 1 mM二硫苏糖醇(DTT), 0.1 mM苯甲基磺酰氟,leupeptin (0.04 mg/ml),抑肽酶(0.04 mg/ml), pH 7.5]。在组织分析方面,C57BL/6小鼠(7周龄,雄性)的尾巴或耳朵,头部D. Melanogaster.(W.1118,雄性),或的芽A. Thaliana.(生态型Columbia-0, 14日龄)在ZT5时制备,1 mg组织匀浆于1 ml采样缓冲液中。使用玻璃/特氟隆均质器(20次)将细胞或组织均质。使用CaM-kinase II Assay kit (CycLex, catalog no.)检测裂解物磷酸化合肽-2的CaMKII活性。CY-1173)根据制造商的协议。

为了分析纯化的Camkii活性,磷酸化钟肽(GST-SP),如前所述制备凸轮和大鼠脑CAMKII(1534)。在5°,10°,15°,或20℃下,在由40mM Tris-HCl(pH8.0),2mM DTT,5mM MgCl组成的反应混合物(10μl)中进行测定。2,0.5 mm cacl2,1 mm [Γ-32P] ATP,1μm凸轮,100ng大鼠脑Camkii,以及500ng的GST-SP肽。孵育30分钟后,通过加入10μl2×SDS样品缓冲液停止反应。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分解磷酸化蛋白或肽,并通过放射自显影检测。我们发现从大鼠脑中纯化的Camkii活性通过以前的研究(34)。因此,将纯化的Camkii的活性水平分析在5℃至20℃的范围内。

动物实验

符合东京大学的指导方针进行了动物实验。NCX2杂合敲除小鼠(NCX2+/-)如前所述制造(25)。NCX3纯合滞后小鼠(NCX3- / -)如下产生:通过用PGK(磷酸甘油促酮激酶启动子)-Neo盒代替含有NCX3基因的外显子2的1.9千千碱基对ECO RI-MER-MER-ME片段来构建靶向载体。通过Southern印迹分析证实了靶向ES(胚胎干细胞)克隆,用于产生种系嵌合体。将嵌合的雄性小鼠与雌性C57BL / 6小鼠交叉,以建立种系传递,并从10种以上的C57BL / 6小鼠中交流。突变小鼠(C57BL / 6背景,雄性,6至8周)在配备有食物和水的连续轮(直径10厘米)的笼子(13×23×15cm)的笼子(13×23×15cm)中单独容纳在23°C上自由。在壳体下在12小时光/ 12小时黑暗的循环下持续暗条件下监测车轮运行节律至少2周。每分钟收集轮革命的数量进入计算机系统。通过使用ClockLab软件(Actimetrics)分析所有行为数据。用于测量内部体温,活性和温度测量装置Nano标签(KISSEI Comtec Co.Ltm.)植入小鼠的腹膜腔或皮下部位(C57BL / 6背景,男性,8周龄)。为了测量表面体温,使用红外相机(FLIR,E6),通过FLIR工具软件(FLIR)分析图像数据。

机车活动节奏D. Melanogaster.如前所述(35)。雄蝇(2 ~ 5日龄)分别置于长65 mm的玻璃管中;内径,3mm)一端含蔗糖琼脂(1%琼脂加5%蔗糖)食物,另一端含棉花塞。玻璃管被放置在果蝇活动监测系统(TriKinetics),记录每只苍蝇在1 min箱内的红外光束通过次数。在连续3天的连续黑暗条件下,在12小时光照/12小时黑暗周期下记录自由运行节律。一种或者B.突变苍蝇是从布卢明顿获得的果蝇股票中心。

数学分析

通过使用先前发布的数学模型(23),我们调查了Camkii激活对哺乳动物昼夜时钟TTFL的影响。因为Camkii磷化了时钟以激活时钟BMA1复合物的转录活动(14-17),我们改变了相应的参数,它在原始模型中表示为“PHOS”(23)。用欧拉方法对常微分方程进行了数值求解T.= 0.001。

补充材料

https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

这是一篇开放获取的文章根据创意公共归因许可证如果正确引用了原始工作,则允许在任何媒体中的不受限制使用,分发和再现。

参考和笔记

致谢:我们非常感谢福田市瑞基的冯达实验室的成员,在名古屋城大学J.Tomita,I. Daichi在Waseda大学,H. Ito和M. Seki,K.-i。Homma和S. Honma在北海道大学,以及转型性研究区“冬眠生物学”的成员,有助于讨论。资金:这项工作是由日本科学(JSPS)促进科学研究(Kakenhi)促进科学研究(Kakenhi)至Y.F.的支持。(17H06096),N.KO.(18H06066,20H03292和20H05769)和T.I.(17K08610)。n.ko.对于日本的Tomizawa Jun-Ichi和Keiko基金的年轻科学家和国家生理学研究所的合作学习计划(9273)提供支持。H.-T.W.JSPS研究奖学金为年轻科学家提供支持。作者捐款:n.ko.和Y.F.计划研究项目。n.ko.和h.-t.w.使用哺乳动物细胞和小鼠进行分析。Y.S.K.和k ..使用分析使用果蝇。法医和法医用拟南芥。N.Ka.,K.Ka.和H.I.使用蓝色细胞进行分析。关于。执行了CA.2 +使用鼠标SCN的成像实验。G.K.执行数学模拟。T.N.和Y.S.进行体外Camkii激酶测定。H T。和t.i.生成NCX2和NCX3敲除小鼠,以及T.I.提供了关于NCX淘汰鼠标实验的有用建议,并审查了稿件。 N.Ko. and Y.F. wrote the manuscript with support from all authors.利益争夺:提交人声明他们没有竞争利益。数据和材料可用性:评价论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充资料中。可能要求作者提供与本文相关的其他数据。

保持联系,十搏欧洲杯直播官网

浏览这篇文章