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通过靶向内溶酶体的VAMP4控制突触囊泡释放概率gydF4y2Ba

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十搏欧洲杯直播官网2021年4月30日:gydF4y2Ba
7卷,没有。18日,eabf3873gydF4y2Ba
DOI: 10.1126 / sciadv.abf3873gydF4y2Ba

抽象的gydF4y2Ba

突触囊泡(SV)释放概率(PR)确定神经递质释放的稳态和塑性控制。但是,SV组成中的多样性产生和调节单个SV的PR不了解。我们发现,调制拷贝数的非甘露吞噬圈圈(可溶性gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体),囊泡相关膜蛋白4 (VAMP4),在SVs上是调节Pr的关键。机制上,这是由于其与典型质膜SNAREs形成有效SNARE复合体的能力减弱。VAMP4具有异常高的突触转换,在活性依赖的体内吞过程中被选择性地分类为内溶酶体。内吞酶体转运和功能的破坏显著增加了VAMP4在SV池中的丰度,并抑制了SV融合。总之,我们的研究结果揭示了一种产生SV异质性的新机制,并通过将SV回收与调节蛋白稳态的主要清除系统耦合来控制Pr。gydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

中枢突触上依赖活动的神经递质释放在分子、电路和行为水平上支撑着大脑功能。突触囊泡(Synaptic vesicle, SV)释放概率(Pr)是决定突触如何对活动模式变化作出反应的关键参数之一,其定义为动作电位(action potential, AP)到达时SV融合的可能性。Pr受到许多相互依赖的因素的动态调节,包括突触前钙稳态、SV的随时可释放池(RRP)的大小和SV的异质性(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

圈套(可溶gydF4y2BaNgydF4y2Ba- 乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体)蛋白质是SV融合机械的必需组分,因此PR的关键调节剂。SV R-SNARE Synaptobrevin-2(Syb2)对于诱发同步神经递质是必不可少的(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而,SVS还含有其他R-SNARE蛋白质,包括许多内骨肉粪(gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba),这可能导致SV致病性的差异,提供了一种诱人的机制,通过动态控制Pr在SV上的拷贝数来改变Pr。gydF4y2Ba

形态的均匀性与功能的多样性形成了明显的对比。因此,SV的非均质性主要来自于其分子组成的差异。然而,这种异质性是如何产生的以及它如何影响突触前功能在很大程度上仍是未知的。gydF4y2Ba

人们提出了不同的SV回收模式,通过选择性地标记特定分子来定义SV的功能特征(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。在支持方面,活性依赖的大量内吞作用(ADBE)在强烈的神经元活动中被触发,形成短暂的大量核内体,从核内体中产生富含非典型SNARE囊泡相关膜蛋白4 (VAMP4)的小泡(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

然而,难以想象如何在突触终端中运行的少数回收途径(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)可单独负责决定SV异质性的SV蛋白拷贝数的调节。因此,SV池中特定SV货物的动态掺入和清关可能在推动SV分子组成和功能特性的变化中发挥关键作用。内溶酶体系统包含参与细胞内运输和蛋白质稳态的细胞器,是调节SV池中特定SV蛋白清除的理想候选物(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。局部SV回收和轴突内渗透组织贩运机械之间的分子和功能联系将能够协调调节突触前释放性能和全球质量控制机制,以最佳地支持长期神经元健康和功能。gydF4y2Ba

在本研究中,我们为这种串音控制神经递质释放提供了令人信服的证据。我们发现,调节SV池中VAMP4的拷贝数是Pr的关键决定因素。富含VAMP4的SV由于与典型突触Q-SNAREs的低效相互作用而降低了融合原性。它们也表现出较高的轴突转换率,有大量的池逆行运输通过内溶酶体系统。抑制ADBE或内吞酶体转运和功能显著增加了神经末梢中VAMP4的丰度,从而抑制了SV融合。先前研究表明,适配器蛋白1 (AP1)功能的破坏在SV循环中起着多余的作用(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),损害货物分类到内橄榄糖浆,导致突触富集和减少的Vamp4营业额减少。反过来,gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba敲除(KO)神经终端显示出增强的PR和无法维持突触促进。不存在抑制抑制轴突内渗透压磁通量的SV融合的抑制gydF4y2BaVamp4.gydF4y2BaKO突触,确认Vamp4在将溶酶体功能障碍转化为改变的突触前释放性质时的关键作用。最后,蛋白质组学分析揭示了Vamp4对底糖体和SV融合机械的互殖控制,具有孤立的Vamp4 Ko神经末端的脊柱糖蛋白酶体蛋白的选择性去富集。因此,我们的研究结果将SV回收和轴心底糖组织机械制揭示为连续体,并将VAMP4假设作为一种机制的必要组分,其整合到神经元蛋抑制中的输入特异性活性模式和细胞范围改变至调节Pr。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Vamp4的突触积累降低了SV融合能力gydF4y2Ba

R-SNARE VAMP4在非神经元细胞中建立了内部组到Trans-GOLGI网络(TGN)传输中的细胞作用(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。为了揭示其神经元功能,我们使用免疫组织化学(IHC)检查了从3至4个月大鼠的固定大脑部分的表达。在整个大脑中检测到致密的Vamp4标记,表明潜在的广泛作用(图S1A)。在海马神经元的原代培养物中,神经元细胞体中存在突出的Vamp4的免疫荧光,密切镜像Vamp4相互作用伴侣AP1(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)定位于TGN和核内体(图S1B)。此外,在突触前终末检测到VAMP4的离散点状免疫反应性,尽管对细胞体的水平较低(图S1C)。成年小鼠脑组织的生化分离证实了VAMP4在细胞器和SVs中的高富集(图S1、D和E) (gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。因此,VAMP4在哺乳动物大脑中广泛表达,并具有相当大的突触前表达。gydF4y2Ba

提出了Vamp4以在抑制突触处对异步释放中的作用(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)。然而,非同步释放只在中枢神经系统(CNS)的特殊突触占优势(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),这与VAMP4在哺乳动物大脑中的广泛分布形成了对比。在大多数突触中,SV融合与APs(同步释放)紧密耦合,这使得信息在中枢神经系统内快速传递。因此,我们试图检验VAMP4是否在同步SV融合中具有更普遍的功能。我们首先通过在原代培养的海马神经元中表达基因编码的报告基因来实时可视化SV融合。这些探针通过融合于SV蛋白的腔域的pH敏感荧光片断报告其直接环境的pH值(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。SV融合报告为荧光的增加,因为报告者从酸性SV腔转换到细胞表面上的中性细胞外环境。用SYP-MOR2 [突触甘油蛋白标记用pH敏感的红移Morange2转染神经元;(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba)]和VAMP4-pHluorin或规范SV R-SNARE syb2-pHluorin。在一组高频(40hz, 10 s) ap的挑战中,使用活体神经元(gydF4y2Ba图1,A和B.gydF4y2Ba)。显示出依赖于syp-mOr2反应的突触被归类为活性突触(中白色箭头)gydF4y2Ba图1,A和B.gydF4y2Ba)。平均仅25%的Vamp4-氟素分子在刺激期间访问这些活性突触的细胞表面(gydF4y2Ba图1,A和EgydF4y2Ba)。相比之下,syb2-pHluorin反应紧紧跟踪syb2- mor2和报告的SV融合事件在近100%的活跃突触(gydF4y2Ba图1,B, EgydF4y2Ba)。值得注意的是,当相对于Syb2-氟林素的表达时,在活性突起处的Vamp4-嘌呤素表达明显降低(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)。这表明,增加VAMP4的表达可能限制SV融合过程中的神经元活动。gydF4y2Ba

Fig. 1 Synaptic accumulation of VAMP4 lowers SV fusion competence.

Primary cultures of hippocampal neurons were cotransfected with syp-mOr2 and either VAMP4-pHluorin or syb2-pHluorin. Neurons were stimulated with 400 APs (40 Hz) and pulsed with NH4Cl imaging buffer after 200 s. (A and B) Representative images of the fluorescent response of syp-mOr2 (A and B), VAMP4-pHluorin (A), and syb2-pHluorin (B) are displayed at rest, during stimulation, or during exposure to NH4Cl [white arrows, nerve terminals that display a syp-mOr2 response (active synapses); yellow arrows, those that do not (silent synapses)]. Scale bar, 5 μm. (C and D) Hippocampal neurons transduced with PSD95-EGFP after a prior transfection with syp-mOr2 were subjected to an identical protocol as above. (C) Representative images of syp-mOr2 and PSD95-EGFP at rest, during stimulation, or during NH4Cl exposure (white arrows, active synapses; yellow arrows, silent synapses). Scale bar, 5 μm. (D) Number of active or silent syp-mOr2 puncta colocalizing with PSD95-EGFP (n = 13 coverslips from four independent preparations, P = 0.82, Mann-Whitney test). (E and F) Number of synapses with fusion events reported by pHluorin (E) or the expression level of pHluorin at synapses that show an activity-dependent syp-mOr2 response (F). n = 15 coverslips, each from four independent preparations, ****P < 0.001 and ***P = 0.001, Mann-Whitney test. (G to I) Expression level of syb2-pHluorin (G), sypHy (H), and VAMP4-pHluorin (I) at active and silent synapses. n = 10 (G) or n = 14 (H and I) coverslips from four independent preparations, ***P = 0.0005, **P = 0.002, and *P = 0.039, either Wilcoxon matched-pairs signed-rank test (G and I) or paired t test (H). (J to L) Correlation between the extent of the sypHy response with the expression of sypHy (J) or the syp-mOr2 response with the expression of syb2-pHluorin (K) and VAMP4-pHluorin (L). ns, not significant.

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图。1gydF4y2Ba Vamp4的突触累积降低了SV融合能力。gydF4y2Ba

用syp-mOr2和VAMP4-pHluorin或syb2-pHluorin共转染原代培养的海马神经元。用400个APs (40 Hz)刺激神经元,用NH脉冲gydF4y2Ba4gydF4y2Ba200秒后Cl成像缓冲(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Basyp-mOr2 (A和B)、VAMP4-pHluorin (A)和syb2-pHluorin (B)的荧光响应的代表性图像显示在休息时、刺激时或暴露于NH时gydF4y2Ba4gydF4y2BaCL [白色箭头,显示SYP-MOR2响应的神经终端(活动突触);黄色箭头,那些没有(沉默突触)的人]。比例尺,5 μm。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba和gydF4y2BaDgydF4y2Ba)用PSD95-EGFP转导后用SYP-MOR2转染后转导的海马神经元进行相同的方案。(c)SYP-MOR2和PSD95-EGFP的代表性图像在休息期间,刺激期间或在NH期间gydF4y2Ba4gydF4y2BaCL曝光(白色箭头,有效突触;黄色箭头,静音突触)。比例尺,5 μm。(d)与PSD95-EGFP的主动或静音SYP-MOR2旁观旁路数(gydF4y2BangydF4y2Ba=来自四个独立准备的13个盖帽,gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.82,Mann-Whitney测试)。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba和gydF4y2BaFgydF4y2Ba)通过荧光素(e)报告的融合事件的突触数或污染表达水平,显示突触的突出物,显示活动依赖于活动的SYP-MOR2响应(F)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 15个盖帽,每一个来自四个独立的准备,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001和***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.001, Mann-Whitney检验。(gydF4y2BaGgydF4y2Ba至gydF4y2Ba我gydF4y2Ba)在活性和沉默突触处的SYB2-氟蛋白(G),Syphy(H)和Vamp4-荧光素(I)的表达水平。gydF4y2BangydF4y2Ba= 10 (G)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 14(h和i)覆盖来自四个独立制剂,***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0005,**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.002,和*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.039,无论是Wilcoxon匹配对签名 - 等级测试(g和i)还是配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试(h)。(gydF4y2BaJgydF4y2Ba至gydF4y2BalgydF4y2BasypHy反应的程度与sypHy的表达(J)或syp-mOr2反应与syb2-pHluorin (K)和VAMP4-pHluorin (L). ns的表达之间的相关性均不显著。gydF4y2Ba

下面的一系列实验证实了这一假设。一小部分表达syp-mOr2的突触(占每个视场所有突触的35%)没有诱发SV融合事件(静默突触;黄色箭头gydF4y2Ba图1,A和B.gydF4y2Ba)。这也是单独用Syphy(Sypaptophysin-Phluorin)转染的神经元的情况。SYP-MOR2簇的分层分析和兴奋性突触后标志物PSD95-EGFP(增强的绿色荧光蛋白)显示出在激活和沉默突触(gydF4y2Ba图1,C, DgydF4y2Ba)。此外,固定神经元培养物中的HOC分层化分析报告了Vamp4-氟林素,SYB2-氟素和内源性PSD95之间的相似程度的分致化(图S1,F和G)。这证实了大多数突触前静默突触是结构完整的,真正的突触。值得注意的是,在这些静脉突触处的Vamp4-氟释放酶的表达显着高于来自同一神经元的活性突触(gydF4y2Ba图1,a和igydF4y2Ba)。相反,与活跃突触相比,沉默突触的sypHy和syb2-pHluorin表达减少(gydF4y2Ba图1,B,G和H.gydF4y2Ba)。进一步的分析揭示了诱发突触反应(Syphy或Syp-Mor2峰值高度)的振幅与个体突触中的Syby和Syb2-荧光素的表达水平之间的显着正相关性gydF4y2Ba图1,J, KgydF4y2Ba)。相反,VAMP4-pHluorin的表达与突触反应呈显著负相关(gydF4y2Ba图1 lgydF4y2Ba)。这些研究结果表明,Vamp4的突触富集降低了SV融合并揭示了Vamp4作为Pr的潜在负调节器。此外,它们暗示需要突触活动来维持神经终端中的Vamp4的低表达,揭示了突触促进的潜在输入特异性反馈机制。gydF4y2Ba

Vamp4在突触活动期间没有高效地形成圈套复合物gydF4y2Ba

VAMP4可能通过干扰syb2介导的SNARE复合体组装来负调控Pr。VAMP4 SNARE基序的氨基酸序列与syb2相似(62%);然而,它们之间的重要序列变化(图S2A) (gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)可以巧妙地改变圈套复杂形成的动力学。因此,我们接下来确定Vamp4是否可以与血浆膜Q-Snares响应具有与SyB2相同效率的神经元活动形成血管膜Q-Snares。gydF4y2Ba

为了实现这一点,我们使用荧光寿命成像(Flim)测量表达YFP(黄色荧光蛋白)的活神经元的突触的Förster共振能量转移(FRET) - 用于凝结的Syntaxin1a和Merululan(Metrulan)-Tagged Syb2或Vamp4(gydF4y2Ba图2,A, EgydF4y2Ba)。当具有重叠发射/激发光谱的两个荧光团的物理分离小于10nm时,发生焦点,导致供体(例如MOR)在激发状态下花费的时间减少。在我们的设置中,将检测与yfp-syntaxin1a的相互作用作为Mcor-Vamp4或Mor-Syb2的荧光寿命的减少。获得静止和高频刺激(40Hz,20秒)时相同的突触前终端的FLIM图像,并计算麦克兰的荧光寿命(gydF4y2Ba图2,B, C, F, GgydF4y2Ba)。在刺激期间,用Mcor-Syb2和YFP-综合症1A分配的神经元突触的平均摩尔荧光寿命显着降低,表明褶皱增加了(gydF4y2Ba图2,B,D,I和JgydF4y2Ba)。这与响应突触活动的脉冲复合物中这两个分子的接合一致。相反,在用Mcor-Vamp4和YFP-Syntaxin1a的神经元的刺激期间检测到麦焦荧光寿命的可忽略不计的麦芽糖荧光寿命期间(gydF4y2Ba图2,f到jgydF4y2Ba)。在仅用供体mCer-syb2转染的神经元中,没有观察到休息和刺激条件之间的差异,不包括对FRET测量的非特异性影响(图S2, B至F)。基于flimf的FRET独立于供体浓度,因为荧光寿命是每个荧光团的固有特征;然而,它会受到受体浓度的影响。然而,在mCer-VAMP4 -和mcer -syb2 -富集的突触中,没有检测到YFP-syntaxin1a表达的差异,排除了可变受体浓度对FRET读数的影响(图S2、G和H)。因此,VAMP4无法以依赖活动的方式与典型的突触Q-SNAREs有效地相互作用,这可能解释了为什么它在SVs上的丰度增加使得它们的融合能力降低。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba VAMP4在突触活动中不能有效地形成SNARE复合物。gydF4y2Ba

用YFP-和皂苷1A和MCOR-SYB2或MCOR-VAMP4分配海马神经元的原发性培养物,并用800 AP(40Hz)刺激,同时监测MCOR供体的荧光寿命(τ)。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2BaEgydF4y2Ba, 和gydF4y2BaFgydF4y2Ba)荧光强度(A和E)或τ的代表性图像[使用伪颜色以前报告τ(B和B)或MCOR-VAMP4(E和F)之前的τ(B和F)(控制)或(40-Hz,20-s)刺激期间。秤条,10μm。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba,gydF4y2BaGgydF4y2Ba, 和gydF4y2BaHgydF4y2Ba)从(B)和(F)实验中分别得到的mCer-syb2 (C和D)或mCer-VAMP4 (G和H)的归一化荧光衰减(C和G)和τ (D和H)。(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba) ΔFRET表示刺激前后mCer-syb2或mCer-VAMP4 τ的平均变化。(gydF4y2BaJgydF4y2Ba)为所有条件显示平均τ。gydF4y2BangydF4y2Ba=来自7个独立实验的301个神经终端(SYB2)和gydF4y2BangydF4y2Ba=来自17个独立实验(Vamp4),Mann-Whitney测试(I)的256神经终端,与DUNN的多个比较测试(J),****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001。IRF,仪器响应功能。gydF4y2Ba

通过底糖体系统组成型抗遮挡体积从轴突中检索gydF4y2Ba

增加的神经元活性导致通过底糖体系统加速降解突触蛋白,以防止在重复SV回收过程中损坏的累积(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。参与回收显示的SVS减少了融合度(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)并且可以形成被称为突触刺激无法访问的SV的“休息池”。我们认为VAMP4对SV的累积,降低了它们的融合度,标志着消除突触的非活动的SV亚级。这些囊泡的减少融合能力可能是远程贩运的有利可能是有利的,因为它将防止其融合在运输中。因此,我们假设Vamp4应该具有比其他SV蛋白更高的突触周转率,因为它将连续从轴突中排出。gydF4y2Ba

为了评估VAMP4轴突翻转,我们首先使用波动图分析比较了VAMP4- egfp在远端轴突区域的整体移动性和贩运模式与syb2-EGFP的贩运行为(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。我们发现在成熟神经元的轴突中存在一个高流动性的VAMP4-EGFP池[13 - 15天体外(DIV)],与syb2-EGFP相比,VAMP4-EGFP显示出明显的逆行转运偏倚(gydF4y2Ba图3,A和B.gydF4y2Ba)。我们还发现VAMP4-EGFP囊泡的逆行轴突运输能力增加,与syb2-EGFP相比,这些囊泡的平均运行长度明显更高(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。因此,我们得出结论,含Vamp4的囊泡在基础活性期间从轴突上表现出增加的间隙。gydF4y2Ba

Fig. 3 VAMP4 is retrieved constitutively from axons through the endolysosomal system.

(A) Representative kymographs display the axonal mobility and directionality of traffic of VAMP4-EGFP and syb2-EGFP. (B and C) Frequency of anterograde, retrograde, or stationary trajectories (B) or the run length of retrograde trajectories (C) for both syb2-EGFP and VAMP4-EGFP. n = 25 (syb2) or n = 16 coverslips (VAMP4) from four independent preparations, ****P < 0.001 and **P = 0.0002, two-way ANOVA with Fisher’s least significant difference (B), and **P = 0.0012, unpaired t test (C). (D and E) Hippocampal neurons were transfected with syb2, synaptophysin, or VAMP4 tagged with an FT protein. (D) Representative images display FT protein fluorescence in either the blue (new protein), red (old protein), or merged channel. Scale bar, 5 μm. (E) Blue/red ratio of FT proteins. n = 24 (syb2 and synaptophysin) or n = 23 cells (VAMP4) from four independent preparations, ****P < 0.001 and ***P = 0.0004, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparisons test. (F to H) Hippocampal neurons were transfected with mCherry-rab7 and either syb2-EGFP or VAMP4-EGFP. (F and G) Kymographs show the retrograde cotrafficking of syb2-EGFP and VAMP4-EGFP with mCherry-rab7. (H) Fraction of retrograde trajectories where syb2-EGFP or VAMP4-EGFP cotraffic with mCherry-rab7. n = 16 (syb2) or n = 18 (VAMP4) coverslips from four independent preparations, ****P < 0.001, Mann-Whitney test.

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图3.gydF4y2Ba VAMP4通过内溶酶体系统从轴突获得。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)代表性的脉波描记器显示了VAMP4-EGFP和syb2-EGFP的轴突移动性和交通的方向性。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba和gydF4y2BaCgydF4y2Basyb2-EGFP和VAMP4-EGFP的顺行、逆行或静止轨迹的频率(B)或逆行轨迹的运行长度(C)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 25 (syb2) orgydF4y2BangydF4y2Ba= 16个coverlips (VAMP4)来自四个独立的准备,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001和**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0002,双向ANOVA,具有Fisher的最低差异(b),**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0012,未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试(C)。gydF4y2BaDgydF4y2Ba和gydF4y2BaEgydF4y2Ba)用标记有FT蛋白的syb2、synaptophysin或VAMP4转染海马神经元。(D)代表性图像显示FT蛋白荧光为蓝色(新蛋白)、红色(旧蛋白)或合并通道。比例尺,5 μm。(E) FT蛋白的蓝/红比值。gydF4y2BangydF4y2Ba= 24(SYB2和Sypaptophysin)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 23个细胞(VAMP4)来自4个独立的制剂,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001和***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0004,kruskal-wallis测试与Dunn的多个比较测试。(gydF4y2BaFgydF4y2Ba至gydF4y2BaHgydF4y2Ba)用MCherry-Rab7和Syb2-EGFP或Vamp4-EGFP转染海马神经元。(F和G)脑脑管镜显示SYB2-EGFP和VAMP4-EGFP的逆行COTRAFFICK,MCHERRY-RAB7。(h)逆行轨迹的分数,其中Syb2-EGFP或Vamp4-EGFP CoTraffic与MCherry-Rab7。gydF4y2BangydF4y2Ba= 16 (syb2)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 18 (VAMP4)覆盖四个独立的准备,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001, Mann-Whitney检验。gydF4y2Ba

我们接下来确定了神经元活动增加对Vamp4和SyB2的轴突贩运的影响。突触刺激(40Hz,10 s)显着降低了SyB2-EGFP囊泡的移动分数并增加了固定颗粒的数量(图S3,A至D)。它还略微降低了Vamp4-EGFP的平均逆行运行长度(图S3H)。这些结果强调,突触活动对轴突运输具有全球影响,同意先前的观察结果表明突触刺激减少了膜细胞器和单分子尸体的流动性(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。然而,增强的神经元活动不会影响移动版本4-EGFP囊泡的方向性或整体数量(图S3,e至g),支持这些囊泡的概念以维持突触终端和神经元之间的长距离运输细胞体。gydF4y2Ba

SV货物通常在突触处表现出较低的周转率(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。然而,来自突触的Vamp4的增强逆行通量表明其神经终端中的寿命可能低于其他SV蛋白。直接比较Vamp4的突触前周转率与其他SV蛋白的突触率,我们用MCHerry衍生的单体荧光定时器(FT)标记Vamp4,Syb2和Sypaptophysin(FT) -gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。该荧光蛋白随着时间的推移而变为红色的荧光,因此,蓝逆信号的比例提供了标记蛋白的相对年龄的准确估计。当评估时,SYB2-FT和Sypaptophysin-FT的蓝色到红率与长突触寿命相比相当且相对较低(gydF4y2Ba图3,D, EgydF4y2Ba)。相比之下,VAMP4-FT的红色形态在神经末梢中几乎检测不到,而且它的蓝-红比值增加了两倍,这表明突触前转换速度很快(gydF4y2Ba图3,D, EgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

小鸟苷三磷酸酶(GTPAse)Rab7将突触前的内吞作用伴有快速逆行轴突运输,并且是晚期内体,自血药物和溶酶体的成熟所需的(这里统称为鼻内肌肉)(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。为了确定轴突中Vamp4逆行载体的性质,我们将Vamp4-EGFP和Syb2-EGFP的逆行Cotrafficing用MCherry标记的RAB7,使用在活神经元中的双色延时成像。而少于50%的SYB2-EGFP囊泡在逆行方向上用MCHERRY-RAB7 COTRAFFICKED,而近100%的VAMP4-EGFP葡萄干显示逆行COTRAFFICKING(gydF4y2Ba图3,F到HgydF4y2Ba)。这表明VAMP4逆行载体是轴突内溶酶体隔室的一部分。总之,这些结果表明,VAMP4具有很高的SV货物突触前周转率,大量富含VAMP4的小泡通过内溶酶体系统被组成性地贩运到神经元胞体。gydF4y2Ba

ap1介导的VAMP4向内溶酶体的分选调节其在SV池中的丰度gydF4y2Ba

为了确定VAMP4的内溶酶体转运在其轴突转换中的重要性,我们表达了小GTPase rab7的构成活性(Q67L)或显性阴性(T22N)突变体,并评估了它们对VAMP4突触表达的影响。Q67L rab7不能水解鸟苷5 ' -三磷酸(guanosine 5 ' -triphosphate, GTP),但其过表达对轴突细胞器运输的影响存在争议(gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。相比之下,T22N rab7对GTP的亲和力降低,其过表达显著失调轴突核内体运输和信号转导(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba)。野生型MCHERRY-RAB7或Q67L突变体的表达对VAMP4-氟化蛋白的轴突表达没有影响(gydF4y2Ba图4,A, BgydF4y2Ba)。相反,T22N mCherry-Rab7的表达显着增加了大约双重的Vamp4-氟林蛋白的突触表达(gydF4y2Ba图4,A, BgydF4y2Ba)。在表达T22N mCherry-rab7的神经元中,sypHy的突触表达也有所增加,但幅度较小(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。这意味着VAMP4不成比例地通过轴突内溶酶体系统从神经末梢被贩运出去。抑制内吞酶体运输不仅增加了神经末梢中vamp4 - fluororin的丰度,而且刺激了其在回收SV池中的合并(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。这是由Vamp4-荧光素的融合增加,响应于T22N Rab7表达神经元的刺激(40 Hz,10 s)的融合增加(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。因此,VAMP4提供了内吞酶体和SV循环机制之间的分子连接。gydF4y2Ba

图4.gydF4y2Ba VAMP4的内溶酶体分选调节其在SV池中的丰度。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba)海马神经元共转染VAMP4-pHluorin和野生型(WT)、构成型活性(Q67L)或显性阴性(T22N) mCherry-rab7。比例尺,5 μm。代表性图像(A)和柱状图(B)显示了突触VAMP4-pHluorin的表达。gydF4y2BangydF4y2Ba= 23 (mCherry),gydF4y2BangydF4y2Ba= 12 (mCherry-rab7),gydF4y2BangydF4y2Ba= 13(Q67L),和gydF4y2BangydF4y2Ba= 18(T22N)来自四个独立制剂的盖帽,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001,Kruskal-Wallis测试与Dunn的多重比较测试。(gydF4y2BaCgydF4y2BaT22N MCherry-Rab7过表达对梅毒突触表达的影响。gydF4y2BangydF4y2Ba= 21(麦克里)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 16(T22N MCHerry-RAB7)盖板来自四个独立制剂,***gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0002, Mann-Whitney检验。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba)通过在(a)和(b)所示的条件下,在40 hz的400个AP刺激时,Vamp4-嘌呤素报告的融合事件在40 Hz上,gydF4y2BangydF4y2Ba= 23 (mCherry),gydF4y2BangydF4y2Ba= 12 (mCherry-rab7),gydF4y2BangydF4y2Ba= 13(Q67L),和gydF4y2BangydF4y2Ba= 18 (T22N)覆盖四个独立的准备,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0129, Kruskal-Wallis检验及Dunn多重比较检验。gydF4y2Ba

内溶酶体途径在突触衰老和神经退行性变中起核心作用,其共同特征是不可溶蛋白种类和蛋白质聚集体的积累导致溶酶体功能障碍(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。因此,我们接下来决定抑制子肿瘤蛋白抑制子毒性蛋白质的突触型Vamp4的突触前周转。为了实现这一点,我们过表达了两种不同的聚集 - 易于蛋白质被溶酶体清除(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。这些是(i)一个致病突变体α-synuclein (A53T)被提议通过抑制溶酶体降解来发挥作用(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)和(ii)突触前细胞基质的主要成分之一,Bassoon,它在神经元胞体中形成大的聚集物,并在多发性硬化症中导致神经退行性变(图S4A) (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。两种干预措施显着增加了Vamp4-EGFP的突触表达(gydF4y2Ba图5,A, BgydF4y2Ba),支持负担内溶解体降解系统的观念导致Vamp4的突触表达增加。gydF4y2Ba

Fig. 5 AP1-mediated sorting of VAMP4 to endolysosomes regulates its abundance in the SV pool.

(A, C, and E) Representative images display hippocampal neurons transfected with VAMP4-EGFP and mCherry, α-synuclein A53T, or red fluorescent protein (RFP)–bassoon (Bsn) (A), VAMP4-EGFP–transfected neurons with and without 30 μM SMIFH2 (C) and VAMP4-EGFP cotransfected with either AP1 shRNA (AP1 KD) or a scrambled (Scr) control (E). Scale bars, 5 μm. (B, D, and F) Synaptic VAMP4 expression under all conditions described in (A), (C) and (E). (B) n = 40 (mCherry), n = 51 (α-synuclein A53T), and n = 53 (bassoon) cells from three independent preparations, ****P < 0.001 and **P = 0.0038, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparisons test (P values adjusted). (D) n = 47 (control) and n = 61 (SMIFH) cells from three independent preparations (F), n = 18 coverslips (scrambled and AP1 KD) from four independent preparations, ***P = 0.0009 and **P = 0.0085, Mann-Whitney test. (G and H) Hippocampal neurons were transfected with either wild-type or VAMP4 L25A–FT. (G) Representative images display fluorescence in the blue (new protein), red (old protein), or merged channel. Scale bar, 5 μm. (H) Blue/red ratio [n = 30 (wild-type) and n = 39 (L25A) cells from four independent preparations, ****P < 0.001, Mann-Whitney test]. (I to K) Hippocampal neurons cotransfected with VAMP4-pHluorin and or shRNAs against either AP1 or CHC (or scrambled). Representative images (I) (scale bar, 5 μm) and quantification of VAMP4-pHluorin expression (J) in either scrambled or CHC KD synapses [n = 12 (scrambled), n = 14 (CHC KD) coverslips from three independent preparations, *P = 0.011, Mann-Whitney test]. (K) VAMP4-pHluorin fusion events [n = 12 (scrambled), n = 10 (AP1 KD), and n = 14 (CHC KD) coverslips from three independent preparations, ****P < 0.0001 and **P < 0.01, Kruskal-Wallis test with Dunn’s multiple comparisons test].

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图5.gydF4y2Ba AP1介导的Vamp4对底糖体的分类调节其在SV池中的丰富。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba,gydF4y2BaCgydF4y2Ba, 和gydF4y2BaEgydF4y2Ba)代表图像显示海马神经元转染VAMP4-EGFP和mCherry,α-核蛋白A53T,或红色荧光蛋白(RFP)巴松管(Bsn) (A), VAMP4-EGFP-transfected神经元有或没有30μM SMIFH2 (C)和VAMP4-EGFP cotransfected与AP1成分(AP1 KD)或炒(Scr)控制(E),规模酒吧、5μM。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba,gydF4y2BaDgydF4y2Ba, 和gydF4y2BaFgydF4y2Ba)在(A), (C)和(E)中描述的所有条件下突触VAMP4的表达。gydF4y2BangydF4y2Ba= 40(麦克里),gydF4y2BangydF4y2Ba= 51(α-突触核蛋白A53T),和gydF4y2BangydF4y2Ba= 53(巴西)来自三个独立制剂的细胞,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001和**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0038, Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba值调整)。(d)gydF4y2BangydF4y2Ba= 47(对照)和gydF4y2BangydF4y2Ba来自三个独立制剂(F)的61(SMIFH)细胞,gydF4y2BangydF4y2Ba= 18个独立制剂的coverlips (scramble and ap1kd), ***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0009和**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0085,Mann-Whitney测试。(gydF4y2BaGgydF4y2Ba和gydF4y2BaHgydF4y2Ba)海马神经元分别转染野生型和VAMP4 L25A-FT。(G)代表性图像以蓝色(新蛋白)、红色(旧蛋白)或合并通道显示荧光。比例尺,5 μm。(H)蓝/红比率[gydF4y2BangydF4y2Ba= 30(野生型)和gydF4y2BangydF4y2Ba来自四个独立制剂的39(L25A)细胞,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.001,Mann-Whitney测试]。(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba至gydF4y2BaKgydF4y2Ba)海马神经元共转染VAMP4-pHluorin和或shrna对抗AP1或CHC(或乱码)。代表性图像(I)(比尺,5 μm)和乱序或CHC KD突触中VAMP4-pHluorin表达(J)的定量[gydF4y2BangydF4y2Ba= 12(炒),gydF4y2BangydF4y2Ba= 14(CHC KD)盖板来自三个独立制剂,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.011, Mann-Whitney test]。(K) vamp4 - fluororin融合事件[gydF4y2BangydF4y2Ba= 12(炒),gydF4y2BangydF4y2Ba= 10 (AP1 KD)gydF4y2BangydF4y2Ba= 14 (CHC KD)覆盖三个独立制剂,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001和**gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01, Kruskal-Wallis检验与Dunn多重比较检验]。gydF4y2Ba

在突触,VAMP4在突触活动期间通过ADBE进行交易(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。因此,我们接下来确定其通过批量内体的内吞贩运是否需要靶向底糖糖。ADBE通过在我们的神经元培养物中的内在神经元网络活性引发,如流体相标记四甲基二胺(TMR) - 氘(40kDa)的鲁棒摄取所示(图S4B)。接下来,我们决定了在该过程的不同阶段中断的两个独立干预措施是否也增加了预先期间的VAMP4水平。这些是用甲状腺素抑制剂小分子抑制剂的甲状腺同源2结构域(SMIFH2)的处理,其阻断散装胎体的形成(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)或短发夹RNA(ShRNA)介导的AP1耗尽,其损失了来自突触前底皮物的囊泡的萌芽(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)(图S4, C和D)。在这两种情况下,抑制ADBE导致了突触前VAMP4的强劲积累(图S4, C和D)。gydF4y2Ba图5,c至fgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

为了确定破坏AP1结合是否也影响了Vamp4的突触息造环,我们检查了AP1相互作用缺陷的Vamp4突变体[Vamp4 L25A(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)]用ft标记。VAMP4 L25A-FT在与野生型Vamp4-FT相比时,在神经终端中显示出显着降低的蓝色与红色比率(gydF4y2Ba图5,g和hgydF4y2Ba)。这表明AP1结合除了调控其突触前表达外,还促进了VAMP4的突触转换。接下来,我们确定ap1耗尽的神经元中VAMP4的突触前积累是否影响其活性依赖(40hz, 10 s)的贩运。AP1 KD(敲低)导致了与在表达T22N rab7的神经元中观察到的相似的表型,即在高频刺激期间VAMP4-pHluorin融合事件的数量显著增加(gydF4y2Ba无花果。4DgydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 kgydF4y2Ba)。这表明,在没有AP1的情况下,VAMP4在回收SV池中积累。gydF4y2Ba

作为一种异四聚体适配器蛋白,AP1通过与网格蛋白晶格相互作用将货物装载到新生的囊泡中。因此,我们下一步确定网格蛋白重链(CHC;图S4、E和F)以类似于AP1 KD的方式影响vamp4 - fluororin的表达和活性依赖转运。与之一致的是,CHC KD神经元在神经终末表现出VAMP4的积累增加(gydF4y2Ba图5,i和jgydF4y2Ba)。然而,这并不伴随着诱发的Vamp4-氟素融合事件的增加(gydF4y2Ba图5 kgydF4y2Ba)。这些数据表明,AP1和Clathrin在VAMP4的突触前分类中分散而不是相同的角色,并且AP1具体地将Vamp4分选到内橄榄糖酵母,并且潜在地将VAMP4分类为底糖苷和SV。gydF4y2Ba

这些数据在一起表明Vamp4的突触前丰度和活动依赖性贩运构成了一种可调节机构,其反映了SV回收和内溶解体降解机制的功能状态。这些结果还发现在SV回收过程中靶向内吞适配器AP1的先前未识别的内吞适配器AP1在SV货物上靶向肌底糖。gydF4y2Ba

VAMP4 KO突触内溶酶体分子减少,但SV蛋白质组无差异gydF4y2Ba

我们已经证明,SV池中的VAMP4拷贝数限制了SV的融合原性,其突触前表达是由ADBE清除和靶向内溶酶体决定的。为了确定在缺少VAMP4的情况下这些事件是如何被扰乱的,我们生成了一个gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba使用CRISPR-CAS9介导的基因编辑KO鼠标线(图S5A)。删除这一点gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba基因不会破坏后代的孟德尔分布或导致过早死亡。然而,雄性KO小鼠由于精子发生缺陷而不育,这与VAMP4在精子头部发育和顶体囊泡融合中的重要作用一致(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

免疫印迹(immunoblotting)和免疫组化(IHC)均证实了KO动物大脑中VAMP4蛋白的表达被消除(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba和图S5B)。脑切片免疫组化显示野生型和VAMP4 KO小鼠的细胞结构无明显差异(图S5C)。此外,在从VAMP4 KO小鼠(gydF4y2Ba图6,A和B.gydF4y2Ba和图S5,D和E)。这些结果表明删除了gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba基因对突触架构没有一般不利影响,蛋白质表达没有明显的补偿性改变。gydF4y2Ba

Fig. 6 VAMP4 KO synapses display a reduction in endolysosomal molecules and increased SV fusion.

(A and B) Wild-type and VAMP4 KO brain lysates were immunoblotted for synaptic and endosomal proteins (all n = 3 animals, t test with Benjamini, Krieger, and Yekutieli correction for false discovery rate). MW, molecular weight. (C to F) MS analysis of synaptosomes from wild-type and VAMP4 KO brains (five animals for both wild-type and VAMP4 KO). (C) Unique proteins. (D) Volcano plot of significantly different proteins. Refer to data file S1 for full protein names in C and D. (E and F) GO cellular compartment analysis of increased/unique (E) and decreased/absent (F) proteins in VAMP4 KO synaptosomes. (G and H) Wild-type and VAMP4 KO cultures incubated with fluorescent-conjugated antibodies to synaptotagmin 1 (Syt1) were stimulated with 400 APs (40 Hz) and 50 μM TMR-dextran. (G) Representative images (Syt1, TMR-dextran, and merged). Scale bar, 5 μm. (H) TMR-dextran puncta per field of view normalized to Syt1 puncta. n = 17 coverslips from three independent preparations (both), *P = 0.0238, Mann-Whitney test. (I and J) Average time course of the sypHy response normalized to either the stimulation peak (I) or total SV pool [revealed by NH4Cl application (J)]. Stimulation indicated by bar. (K) Peak sypHy response as a fraction of the total SV pool. n = 11 coverslips from three independent preparations (both), *P = 0.043, unpaired t test.

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图6.gydF4y2Ba VAMP4 KO突触显示内吞酶体分子减少和SV融合增加。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba和gydF4y2BaBgydF4y2Ba)野生型和Vamp4 KO脑裂解物被免疫为突触和内体蛋白(所有gydF4y2BangydF4y2Ba= 3的动物,gydF4y2BatgydF4y2Ba用Benjamini, Krieger和Yekutieli对错误发现率的修正进行测试)。MW,分子量。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba至gydF4y2BaFgydF4y2Ba)对野生型和VAMP4 KO(5只野生型和VAMP4 KO)大脑突触体的MS分析。(C)独特的蛋白质。(D)火山图显著不同的蛋白质。关于C和d (E和F) GO细胞室中VAMP4 KO突触体中增加/唯一(E)和减少/缺失(F)蛋白的分析,参见数据文件S1。(gydF4y2BaGgydF4y2Ba和gydF4y2BaHgydF4y2Ba)野生型和VAMP4 KO培养物与synaptotagmin 1 (Syt1)荧光缀合抗体孵育后,用400 APs (40 Hz)和50 μM tmr -葡聚糖刺激。(G)代表性图像(Syt1, tmr -右旋糖酐,合并)。比例尺,5 μm。(H)每个视场的tmr -葡聚糖点归一化为Syt1点。gydF4y2BangydF4y2Ba= 17张来自三个独立的准备(两者),*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0238,Mann-Whitney测试。(gydF4y2Ba我gydF4y2Ba和gydF4y2BaJgydF4y2Ba) sypHy反应的平均时间过程归一化为刺激峰值(I)或总SV池[由NH显示gydF4y2Ba4gydF4y2BaCL应用(J)]。杆用杆表示。(gydF4y2BaKgydF4y2Ba)作为总SV池的一部分的峰值sypHy响应。gydF4y2BangydF4y2Ba= 11个覆盖三个独立的准备(两者),*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.043,未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

为了确定是否存在Vamp4中断的特定分子事件,我们接下来进行由野生型或Vamp4 KO小鼠的大脑制备的突触体的蛋白质组学筛选。这种剖析鉴定了3159个蛋白质和小群体,显着改变了野生型和Vamp4 KO突触体之间的表达(gydF4y2Ba图6,C, DgydF4y2Ba,数据文件S1)。此外,特异性蛋白在野生型或VAMP4 KO突触体(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。为了确定如何缺乏Vamp4影响特异性细胞过程,除了在Vamp4kO突触体中显示> 1.5或<0.72的蛋白质之外,我们还对唯一表达蛋白进行了基因本体学(GO)分析,并且显着不同(gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.05)来自野生型。在Vamp4 KO Symaptosomes中观察到与核糖体功能相关的蛋白质的表达增加(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba)。相反,Vamp4 KO突触体中的减少或不存在蛋白质在室内聚集在诸如胚乳,溶酶体和自噬体(gydF4y2Ba图6 fgydF4y2Ba)。这与通过内溶解体系统的选择性贩运VAMP4吻合良好,并在通过该途径调节特定分子通量的作用。缺乏Vamp4 KO神经末端中的SV尸体累积强烈表明缺乏Vamp4对SV蛋白质组没有全局影响。相反,它表明,SV池中的Vamp4拷贝数以及通过内溶血体系的选择性除去,是一种精确和精细可调节的机制,用于控制PR响应神经元活性和蛋白质的变化。gydF4y2Ba

Vamp4 Ko神经元显示SV融合的特定增强gydF4y2Ba

我们接下来决定了是否删除gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba基因影响突触的结构和功能完整性。培养中野生型和Vamp4 KO神经末端的超微结构分析显示突触形态或SV数的差异(图S5,F至H)。此外,免疫细胞化学(ICC)对特定突触蛋白没有明显差异(图S5,I和J)。gydF4y2Ba

我们接下来研究了去除VAMP4表达是否会影响SV的再循环。首先,在一串高频APs (40 Hz, 10 s)中,通过tmr -葡聚糖摄取来监测ADBE。gydF4y2Ba图6,g和hgydF4y2Ba)。然而,在经历ADBE的单个突触末端中的散装底物的数量不受影响,如康复对强刺激的响应的超微结构分析(图S5,K至M)的超微结构分析。接下来,我们使用Syphy确定SV回收的动力学是否受Vamp4 Ko神经元受到影响。由于SVS的快速酸化使内吞作用的速率为限速步骤,因此,Syphy通过监测其荧光猝灭的时间过程来揭示SV内吞作用的速度通过监测其荧光猝灭的时间过程。gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)。在用AP火车(10Hz,30秒)攻击后,在Vamp4 KO神经元中没有干扰Syphy猝灭的动力学,表明Vamp4在SV内吞作用中没有明显作用(gydF4y2Ba图6我gydF4y2Ba)。VAMP4 KO神经元的sypHy反应的诱发振幅(峰高)显著高于VAMP4 KO神经元(gydF4y2Ba图6,J, KgydF4y2Ba)。这意味着KO神经元中SV融合增强,进一步支持了VAMP4作为SV胞饮负调控因子的观点。gydF4y2Ba

海马Vamp4 KO电路显示出现增加,无法维持突触前的便利gydF4y2Ba

为了确定观察到在完整脑电路中的神经递血中的海马培养物中观察到的SV外尿尿中的增强,我们检查了使用全细胞贴片夹具的玉米氨(CA)3-CA1海马突触缺失Vamp4的效果。在野生型和Vamp4 KO突触之间检测到内在特性(表S1)或微型兴奋后突触电流(MEPSC)的频率或幅度的差异(gydF4y2Ba图7,a到cgydF4y2Ba),表明没有Vamp4的缺失不会显着影响突触后神经元或非侵略性的神经递质。gydF4y2Ba

图7.gydF4y2Ba 海马Vamp4 KO电路中的PR增加。gydF4y2Ba

使用来自野生型和Vamp4 Ko小鼠的急性海马切片中的全细胞贴片夹具进行监测CA3-CA1突触的神经递质。(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)示例MEPSC事件。频率 (gydF4y2BaBgydF4y2Ba)及振幅(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)的mEPSC事件。gydF4y2BangydF4y2Ba= 7(野生型)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 4只动物8片(KO)切片,Mann-Whitney test。(gydF4y2BaDgydF4y2Ba) EPSCs的成对脉冲比(PPR)作为刺激间期(10 ~ 200 ms)的函数。gydF4y2BangydF4y2Ba= 17(野生型)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 15 (KO)片从10或9个动物,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001,* * * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001,脉冲数,双向方差分析,Fisher差异最小,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.027,双向ANOVA用于基因型。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba)用10-AP列车刺激的切片诱发EPSC振幅(20Hz,归一化到第一脉冲)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 10(野生型)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 7或6只动物的9片(KO)切片,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001,双向ANOVA。(gydF4y2BaFgydF4y2Ba和gydF4y2BaGgydF4y2Ba)用600个APS(40 Hz)刺激切片。示例EPSC幅度(F),平均EPSC幅度(归一化至峰值响应)(G)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 10片(均)取自6或8只动物,****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001,双向ANOVA。(gydF4y2BaHgydF4y2Ba)野生型和VAMP4 KO中CA3-CA1突触的Pr,通过第一次诱发EPSC的振幅除以有效RRP的大小计算。gydF4y2BangydF4y2Ba= 10片(均)取自6或8只动物,**gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.039, Mann-Whitney test。gydF4y2Ba

接下来,我们确定了VAMP4 KO对诱发神经传递的影响。将野生型和VAMP4 KO在不同强度(25、50、75和100 μA)刺激下诱发的EPSCs进行比较,发现在整个刺激范围内,VAMP4 KO突触的EPSC振幅增加(图S6A)。与野生型相比,VAMP4 KO切片中的成对脉冲EPSC比例显著降低(gydF4y2Ba图7DgydF4y2Ba)。此外,在短的Vamp4 Ko切片中检测到突触促进衰减的显着增加(10个AP在20 Hz;gydF4y2Ba图7e.gydF4y2Ba)和长(600个ap, 40赫兹;gydF4y2Ba图7 F和GgydF4y2Ba)高频AP刺激的列车。这表明Vamp4有助于调整对变化活动模式的突触响应,并且在Schaffer抵押品-CA1 Synapse处特别需要进行突触促进所必需的。使用遗传编码的谷氨酸传感器,IGLUSNFR(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。当VAMP4 KO神经元受到短AP冲击时(10个AP在20 Hz;就像在gydF4y2Ba图7e.gydF4y2Ba),与野生型相比,轴突中iGluSnFR反应显著降低(图S6、B和C)。gydF4y2Ba

在高频率的刺激下,成对脉冲比率的减少和突触衰弱的增强通常反映了初始Pr的升高(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。为了获得Pr的精确测量,并评估VAMP KO电路中是否发生了改变,首次诱发EPSC的振幅除以有效的RRP大小,这是根据40 Hz的AP训练估计的(图S6D) (gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。刺激列车期间RRP大小和补充都不是野生型和KO之间的显着差异(图S6,E和F);然而,Vamp4 Ko切片中Pr显着高于(gydF4y2Ba图7h.gydF4y2Ba)。我们得出结论,VAMP4 KO海马内的CA3-CA1回路显示Pr增加,导致突触易化的时间过程显著改变。gydF4y2Ba

为了在一个更易于处理的系统中证实观察到的对Pr的影响的特异性,我们使用sypHy成像来量化原代海马培养中SV融合的程度。SV胞吐由连续刺激序列引起(40和900次APs,均以20 Hz传递)(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。为了观察来自SV内吞炎的患者没有污染的SV融合事件,我们在Bafilomycin A1的存在下进行实验,V型腺苷三磷脂酶抑制剂阻断SV ReAciatification,允许整合所有释放事件的荧光幅度(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。这些实验设置通常用于测量可回收资源库和总回收资源库(TRP)的大小,它们通常是一起规模(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)。在VAMP4 KO神经元中,与野生型神经元相比,由40-AP序列引起的荧光振幅显著增加(gydF4y2Ba图8,A和B.gydF4y2Ba)。这不是由于TRP的变化,因为在随后的900个ap训练后,VAMP4 KO和野生型之间的sypHy反应相等(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。当我们归一化由第2列900个ap引起的sypHy对初始PR的反应时,VAMP4 KO神经元中SV融合明显减弱,与PR (gydF4y2Ba图8,C和D.gydF4y2Ba)。通过在KO神经元(gydF4y2Ba图8,a到dgydF4y2Ba)。这表明,VAMP4的缺失在不影响回收sv总数的前提下,提高了RRP中sv的融合能力。总之,这些发现支持了一个模型,根据这个模型,VAMP4通过调节ap训练期间的Pr,在控制短期突触易化方面发挥了关键作用。gydF4y2Ba

图8gydF4y2Ba Vamp4通过抑制SV融合来传达腔内复苏功能障碍。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba至gydF4y2BaDgydF4y2Ba)将转染了sypHy或sypHy + VAMP4- ft (VAMP4 rescue)的海马神经元原代培养,用1 μM巴菲霉素A1孵育,然后用2组20 hz的AP训练(2和45 s, bar表示)刺激,然后用NHgydF4y2Ba4gydF4y2BaCl的解决方案。平均道(A)和初始诱发sypHy响应归一化为总SV池(B)。平均道(C)和sypHy响应归一化为初始响应(Pr) (D)。gydF4y2BangydF4y2Ba= 14(野生型,KO /救援)或gydF4y2BangydF4y2Ba= 15 (KO)八个独立制剂的覆盖物,(B) **gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0015和***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0001,采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析,(D) **gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0077和****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001,Kruskal-Wallis测试与DUNN的多重比较测试。(gydF4y2BaEgydF4y2Ba至gydF4y2BaHgydF4y2Ba)在表达MCHerry-Rab7t22n的神经元中或用30μmsmifh2处理的神经元中的相同实验。(e和f)平均迹线。(g和h)通过MCHerry-Rab7T22N(G)或SMIFH2(H)标准化为野生型或Vamp4 KO对照的抑制溶性响应。gydF4y2BangydF4y2Ba= 16(野生型/ t22n),gydF4y2BangydF4y2Ba= 13 (KO / T22N),gydF4y2BangydF4y2Ba= 22(野生型/ smifh2),和gydF4y2BangydF4y2Ba= 19 (KO/SMIFH2)覆盖四个(G)或三个(H)独立制剂,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.012和***gydF4y2BaPgydF4y2Ba= 0.0003,未配对gydF4y2BatgydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

Vamp4将内糖功能障碍转化为改变的突触前释放性能gydF4y2Ba

通过ADBE在突触前末端的Vamp4的内吞检索及其随后对底糖体分类是优雅的机制,以校准先前神经元活动的SV沉积度和对调节细胞蛋白质的质量控制机制的要求。如果是真,那么抑制Adbe介导的贩运Vamp4至型肌肌瘤应该对SV融合产生显着影响。为了解决这个问题,我们在堵塞轴突内肌肉贩运或ADBE时测量了野生型和Vamp4 KO神经元的SV融合量。通过监测通过在20Hz的40个AP刺激引起的Syphy反应来评估SV融合,并通过刺激引起的Syphy响应(图S7A)。gydF4y2Ba

我们检查了破坏内糖体贩运或ADBE通过显性阴性T22N RAB7的影响或用甲状腺素抑制剂SMIFH2治疗的影响。这两种干预措施都引起了Vamp4的广泛突触积累(gydF4y2Ba图4,A, BgydF4y2Ba, 和gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba),导致野生型神经元SV融合明显抑制(gydF4y2Ba图8,E和F.gydF4y2Ba,和图S7, B和D)。在VAMP4 KO神经元中,阻断SV内吞体循环和内吞酶体贩运对SV融合的影响主要被阻断(gydF4y2Ba图8,E和F.gydF4y2Ba在评估T22N mCherry-rab7或SMIFH2对sypHy反应的抑制程度时,这一点得到了强调。而VAMP4 KO神经元则几乎没有(gydF4y2Ba图8 G和HgydF4y2Ba和图S7,C和E)。因此,Vamp4的存在是必要的,使抑制底糖蛋白酶函数变为Pr的还原。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在这项研究中,我们提出了证明Vamp4是PR的负调节剂的证据,并在SVS中对其丰富的调制赋予其融合性的差异。我们展示了两个复杂的链接机制,调节神经终端中的Vamp4丰度。通过Adbe和indolysoomal系统贩运贩运既是必不可少的,用于在预先期间维持低稳态水平的VAMP4。在音乐会上,这两种贩运路线提供了突触疗效的活性和蛋白质依赖性调整的机制。gydF4y2Ba

Vamp4是PR的负调节器gydF4y2Ba

我们提出了多种证据表明,VAMP4在神经元培养和急性海马切片中限制Pr。例如,VAMP4在单个突触的表达与突触前反应的幅度负相关。我们还证明了VAMP4 KO切片中高频刺激时成对脉冲的可塑性和突触易化性的衰退的变化,这与Pr是突触前短期可塑性的主要决定因素一致(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。我们的结果表明,VAMP4对Pr的控制不是通过调节具有融合能力的SV的数量,也不是通过RRP的大小或补充速率,而是由每SV的Pr的差异所控制。突触易化是广泛应用于中枢神经系统的突触可塑性的一种形式,它能在可释放的神经递质减少的情况下增强神经递质的释放(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。根据定义,重复的高频突触激活突发应导致RRP和短期抑郁的耗尽。然而,在许多突触中,PR以活动依赖性方式增加,归因于在高频刺激期间可用的残留钙信号(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。我们的结果揭示了从SV池中的PR(如VAMP4)的负调节器的活性依赖性调节器的可能性在抵消高频神经递质期间抵消突触抑制方面可能发挥同样重要的作用。gydF4y2Ba

Vamp4在两种其他钙依赖性方面起作用的神经传递,异步释放(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)和钙依赖的mEPSCs (gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。异步释放在特定突触的可塑性中发挥重要作用,但不太可能参与中枢神经系统的快速神经元处理,而是由同步释放介导(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。我们的工作揭示了VAMP4对神经递质释放的全球性影响,与其无处不在的表达一致。在特定的神经元群中,VAMP4在其他释放形式中的额外作用可能仍然存在,但将补充其对Pr的普遍作用。此外,之前观察到的非同步释放的减少(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)可能是在vamp4耗尽的突触上Pr增加的间接结果,因为同步和异步发布是负相关的,因为共享相同的可发布的sv池(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。与先前的观察相比,我们不会观察到Vamp4 KO切片中MEPSC频率的任何变化(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。目前,我们无法为这些差异提供一个机制上的解释;然而,这可能反映了他们所进行的实验系统(原代培养中的shRNA敲低与完整神经元回路中的基因组缺失)。gydF4y2Ba

我们的结果表明,VAMP4在SV上的存在并不是SV融合的二元开关,而是具有调节作用。这是因为包含VAMP4的svv仍然可以进行同步的活性依赖融合。syb2和VAMP4的SNARE主题之间高度相似,这增加了VAMP4与典型的q -SNARE相互作用的可能性(图S2A)。然而,我们的FRET-FLIM数据强烈表明,这种相互作用在突触活动中是无效的。因此,VAMP4突触积累对SV融合的抑制作用可能是其与典型的Q-SNAREs配对无效的直接结果。这种耦合将导致q - snare在结构不稳定且融合能力较弱的复合物中起到缓冲作用,从而阻止它们与同源的R-SNARE伙伴(如syb2)相互作用。因此,我们推测VAMP4相对丰度与阳性(如syb2)或阴性(如amisyn (gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)]胞吐调节因子决定了单个SV的净融合能力。因此,调节VAMP4突触前水平的机制为将突触强度微调到神经元回路的特定要求提供了一个诱人的杠杆。gydF4y2Ba

Adbe和indolysoomal贩运规范SV游泳池中的丰富的VAMP4gydF4y2Ba

通过ADBE选择性地检索Vamp4,并在超微结构水平确认了预突触块状体的富集(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。尽管在任何给定的时间,小部分(25%)的Vamp4参与了SV回收,但其在静音突触处的积累表明其突触活动和ADBE都是其突触终端的间隙所必需的。我们还证明了ADBE使用两个独立的干预措施限制Adbe的两个独立干预措施:抑制Formin(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)AP1的耗尽(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。ADBE抑制对突触前VAMP4水平的影响表明,大部分核内体来源的VAMP4囊泡通过轴突逆行运输被清除。然而,一些VAMP4囊泡在SV池中循环和再合并,这与之前的研究表明ADBE提供了一个SV队列来补充SV储备池(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。因此,大体积核内体可能是突触前的一个关键分选站,它产生功能性储备池SVs和用于降解的囊泡(gydF4y2Ba图9AgydF4y2Ba)。此外,随着AP1的消耗,VAMP4在SV池中的积累表明,这种内吞接头在靶向SV物质到内溶酶体方面具有新的突触作用。除了AP1外,VAMP4的胞质结构域包含与AP180、CALM(网格蛋白组装淋巴白血病蛋白)和PACS-1(磷蛋白酸性簇分类蛋白-1)相互作用的基序(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。因此,可能是不同内吞接头之间的相互作用控制了VAMP4在SV池和内吞酶体之间的分布,而AP1是主调控因子。gydF4y2Ba

图9.gydF4y2Ba 靶向内溶酶体的VAMP4控制Pr。gydF4y2Ba

(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)强烈的突触刺激触发Adbe,其在SV融合之后再循环SV膜和蛋白质,例如SYB2和VAMP4。ADBE形成瞬时体积泡沫的囊泡(I)从中填充再循环SV池(II)或熔断器(成熟)的底糖蛋白,用于远程运输和降解。通过不同的机制将蛋白质分类为块状底物或SVS。Vamp4主要通过AP1依赖性机制将其分选到内溶剂,而SYB2和较小程度,通过不同的衔接蛋白将Vamp4分类为SV。分拣路径都需要克拉仑为其功能。(gydF4y2BaBgydF4y2Ba)在野生型神经终末,无论是抑制内溶酶体运输还是AP1功能,都使VAMP4对内溶酶体的分选失效,导致其在sv中的分选增加。尽管在增产过程中,VAMP4分子访问表面的数量有所增加,但在SV池中积累的VAMP4分子会降低SV融合能力和Pr。(gydF4y2BaCgydF4y2Ba)在VAMP4 KO终端中,VAMP4的缺失会导致基础条件下由于抑制控制的丧失而导致Pr的增加。此外,阻断内溶酶体的转运和功能并不影响Pr,这凸显了VAMP4在将内溶酶体功能障碍转化为突触前释放特性的改变方面的重要作用。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明,除了SV生物发生中的中间体外,散装底皮物与维持蛋白质稳态的细胞内贩运机械的SV再循环整合在内源性系统。通过其异常高的突触流转率,其轴突运输的逆行偏差,与晚期内体标志物Rab7的逆行偏置,揭示了通过内溶解率的SV池从SV池中移除Vamp4。该去除不仅由AP1结合控制,而且还可以通过Vamp4多聚覆盐促进。通过我们在突触末端的突触末端的过表达期间的突触末端的VAMP4积累的证明证实了VAMP4贩运的贩运证实了突出阴性RAB7突变体(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)和两种细胞毒蛋白(α-synuclein A53T和bassoon),它们会破坏神经元的蛋白酶沉积(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

Vamp4 KO突触体的蛋白质组学分析揭示了与内体,溶酶体和自噬体功能相关的蛋白质的选择性去富集。因此,除了作为货物之外,VAMP4还需要用于这些途径的最佳功能,并通过两个系统之间的动态再分配来施加SV回收和内溶解的双向控制。在Vamp4 KO突触体中富集了与核糖体函数有关的不同蛋白质的群体,表明Vamp4,Adbe和底糖体系统是有效的核糖体的有效突触清除所必需的。然而,在预先阶段调节Vamp4依赖性核状物的功能作用和精确机制仍然确定。gydF4y2Ba

通过VAMP4的活性依赖性间隙进行神经递质的塑料控制gydF4y2Ba

虽然确切的机制还不清楚,但关于内吞酶体贩运如何调节突触前的功效已经形成了共识。因此,过量的SV通量内溶酶体导致神经递质释放显著增加(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)。相反,抑制内体再循环和贩运抑制SV融合和神经递质释放(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。结果表明,rab7突变体T22N过表达导致RRP SVs融合能力下降。在抑制ADBE时也观察到RRP - SV融合的这种极限,表明这两个过程之间存在密切耦合。这些作用在VAMP4 KO神经末梢中被阻断,证实了通过ADBE和内溶酶体系统的VAMP4活性依赖的转运在突触强度的调节中起着重要作用(gydF4y2Ba图9.gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

内吞作用途径的精确和准确功能对于从释放地点的裂变位点的补充和清除尿素碎片的腐败和清除,这两者都可以使持续的神经递质(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。我们的研究揭示了SV胞吞-胞吞耦合的新调控层。通过选择性、活性依赖的清除VAMP4, ADBE调节新产生的SVs的组成,以及它们在随后的神经递质释放中融合的倾向。这使得反馈控制和动态调整Pr,调整到突触前活动的历史,同时报告神经元蛋白质组的整体功能。gydF4y2Ba

突触蛋白在重复SV回收过程中累积损坏(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba)。由于内溶血素功能障碍是突触衰老和神经变性的核心(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba), VAMP4可能在神经元病理过程中起到抑制过度兴奋性神经传递的作用。在这种情况下,VAMP4的突触前积累可能提供了一个调节回路,通过这个回路,过载或功能失调的内溶酶体降解系统可以反馈到SV融合机制,以防止损伤的进一步增加,并保护突触功能。总之,我们的数据支持了一个模型,其中VAMP4作为一个分子变阻器,调节Pr以适应特定的输入和细胞范围内的线索,反映了从主要SV循环通道到内溶酶体系统的交通流量。gydF4y2Ba

材料和方法gydF4y2Ba

实验设计gydF4y2Ba

使用功率分析并未预先确定样品尺寸,因为它们不是根据预先限定的效果大小选择的。相反,使用生物学重复进行多个独立实验。样本尺寸的详细描述和用于测试正常性和计算的统计分析gydF4y2BaPgydF4y2Ba在“统计分析”部分,数字图例和表S2中给出了值。通过多个研究人员收集和分析数据,随时可以在实验可能的情况下对条件视而不见。我们的纳入标准的时间序列分析基于所收集数据的质量:例如,在分析中包括显示没有焦点漂移的图像堆栈。实验特定的纳入标准在下面的各个部分中详述。我们的分析中没有省略异常值。gydF4y2Ba

该研究的目的是确定SV回收和内溶解体贩运之间的相互作用如何产生SV异质性并对对照释放神经递质释放。我们假设非Canonical R-Snare Vamp4是一种分子杆,其通过PR调节报告了SV回收和蛋白质的状态。所有实验均在受控实验室设置中进行。gydF4y2Ba

动物gydF4y2Ba

从中获得神经元细胞和脑组织gydF4y2BaVamp4.gydF4y2BaKO,野生型C57BL / 6J小鼠和野生型Sprague-Dawley大鼠的两性。Horizo​​ n Discovery(圣路易斯,莫,美国)产生了gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba在C57BL / 6J背景上的KO小鼠。通过在外显子5中通过10碱基对缺失引入了早期的止锁密码子gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba基因(18009-18018在NC_000067.6中)使用CRISPR-CAS9基因编辑,导致废物介导的mRNA衰减和消除Vamp4蛋白表达。实验,杂合gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba雄性和雌性繁殖产生野生型和KO窝仔对照。gydF4y2Ba

C57BL/6J小鼠来源于爱丁堡大学的内部菌落。斯普拉格-道利鼠来自弗朗西斯·克里克研究所的一个内部种群。所有的小鼠和大鼠群体都被关在标准的开顶笼中,进行14小时的光/暗循环(光线从0700到2100)。大鼠和小鼠饲养者均喂食RM1鼠粮,而饲养大鼠和小鼠喂食RM3鼠粮。gydF4y2Ba

所有的动物工作都是按照1986年英国动物(科学程序)法案进行的,在项目和个人许可证的授权下,并得到了爱丁堡大学动物福利和伦理审查机构的批准(内政部项目许可证给m.a.c.:70/8878)或Francis Crick研究所(内政部项目许可:70/7771)。除灌注固定外,动物按照英国内政部指南的附表1程序安乐死。成人因颈椎脱臼或一氧化碳浓度上升而被安乐死gydF4y2Ba2gydF4y2Ba而对胚胎实施安乐死时,先对其进行斩首,然后对其大脑进行破坏。对特定小鼠进行灌注固定。在此过程中,小鼠给予致死性剂量戊巴比妥钠,经心脏灌注冷磷酸盐缓冲液(PB),然后是冷多聚甲醛(PFA);0.1 M PB中为4%;根据M. Nolan, PC198F2A0的内政部项目许可执行)。gydF4y2Ba

材料gydF4y2Ba

本研究使用以下材料:gydF4y2Ba戴斯。莱纳姆:gydF4y2Ba-2-氨基-5-膦酸(AP-5; AB120271),6-氰基-7-硝基喹喔啉2,3-二酮(CNQX; AB120044),SMIFH2(AB218296)来自ABCAM;来自Stratech的Bafilomycin A1(A8627);neurobasal(21103-049),gydF4y2BalgydF4y2Ba-谷氨酰胺(25030-024),B27补充剂(17504-044),青霉素-链霉素(15140-122),Lipofectamine 2000 (11668-019), NeuroTrace 500/525绿色荧光尼氏染色(N21480),和延长黄金抗褪色贴片(P36930)从Thermo Fisher Scientific;沃辛顿木瓜蛋白酶(LK003176);Biosera中的胎牛血清(S1810-500);Merck Millipore的FluorSave试剂(345789);聚-gydF4y2BadgydF4y2Ba赖氨酸氢溴酸盐(P7886),gydF4y2BadgydF4y2Ba-层粘连蛋白(L2020),胞嘧啶β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-ArabinofuranoSide(C1768),HRP(P8250),3,3'-二氨基苯脲(D8001),Durcupan树脂(44610),蛋白酶抑制剂鸡尾酒(P8849)和来自Sigma-Aldrich的微微毒素(P1675)。gydF4y2Ba

寡核苷酸gydF4y2Ba

使用以下寡核苷酸在该研究中产生质粒。诱变引物(下划线突变的碱)如下:α-突触核蛋白A53T,TGGTGCATGGTGTGgydF4y2Ba一个gydF4y2BaCAACAGTGGCTGAG (forward)和CTCAGCCACTGTTGgydF4y2BaTgydF4y2BaCACACCATGCACCA(反向);Q67L mCherry-rab7, ATGGGACACAGCAGGAgydF4y2BaCTG.gydF4y2BaGAACGGTTCCAGTCTC(转发)和GAGACTGGAACCGTTCgydF4y2BaCAGgydF4y2BaTCCTGCTGTGTCCCAT(反向);T22N mCherry-rab7, TTCTGGAGTCGGGAAGgydF4y2BaAAT.gydF4y2BaTcactcatgaAccagt(向前)和ActggttcatgagtgagydF4y2Baatt.gydF4y2Bacttcccgactccagaa(反向)。克隆引物(下划线的限制性位点)如下:EGFP-SYB2和MCHERRY-SYB2,在gydF4y2BaAGATCTgydF4y2BaATGTCGGCTACCGCTGCCCCG(前进)和GgydF4y2BaGGATCCgydF4y2Battaagtgctgaagtaaacgatgatg(反向);Vamp4 L25A-FT,TCAGgydF4y2BaAGATCTgydF4y2BaATGCCTCCCAAGTTTTAAGCG(前进)和TCAgydF4y2BaACCGG.gydF4y2Battggatccagtacggtttca(反向);SYB2-FT,ATTGTgydF4y2Bactcgag.gydF4y2BaATGTCGGCTACCGCTGCCACGGTCC(前进)和CGTGTTgydF4y2BaGGATCCgydF4y2Bacgagtgctgaagtaaacgatgatgatg(反向);Syspaptophysin-FT,GCGCgydF4y2Bactcgag.gydF4y2BaATGGACGTGGTGAATCAGCTGGTGG(前进)和GCGCgydF4y2BaCCGCGGgydF4y2BaCATCTGATTGGAGAAGGAGGTGGGC(反向);mCherry VAMP4, GCGGCCGCGACTCTAGAT(正向)和TTATAAGGATCCAGTACGGTATTTC(反向)。VAMP4 KO动物基因分型引物为:rev_common、GCGTAAGTCATCATCCAAACAA;Vamp4_kofor CAAACTAGTGTTCAGATGAAG;Vamp4_wtrfor CTAGTGTTCAGAATCAGGTGGA。gydF4y2Ba

DNA结构gydF4y2Ba

以下表达载体用于本研究,并从指定来源获得:sypHy, L. Lagnado(苏塞克斯大学);syp-mOr2, S. Takamori (Doshisha大学,京都,日本);syb2-pHluorin, G. Miesenbock(牛津大学);VAMP4 L25A-pHluorin之前被描述过(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba);YFP-syntaxin1a, R. Duncan (heriowatt University, Edinburgh);红色荧光蛋白(RFP) -Bassoon, C. Garner(德国神经退行性疾病中心,柏林);iGluSnFR, K. Torok(圣乔治,伦敦大学);psPAX2和p-CMV-VSV-G, C. Montenegro-Venegas(莱布尼茨神经生物学研究所,马格德堡,德国);FUp95GW (B7)是由R. Malenka, O. Schluter和W. Xu (Addgene质粒#74016;gydF4y2Bahttp://n2t.net/addgene:74016gydF4y2Ba;RRID: Addgene_74016) (gydF4y2Ba61gydF4y2Ba)。AP1,CHC和Scrambled SHRNA [AP1,CAAACGCATTGGCTTTA(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba);CHC TCCAATTCGAAGACCAAT (gydF4y2Ba62gydF4y2Ba);炒,gatatgatacgataataagca(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)]克隆在PSUPER.NEO + MCHERRY,基于PSUPER.NEO + GFP(gydF4y2Baoligoengine.comgydF4y2Ba),通过Bsh TI和Bsp 1407I酶切位点与mCherry交换GFP进行修饰。将Rab7构建体(原始rab7a序列来自加拿大渥太华大学S. Ferguson)克隆到mCherry C1载体上,该载体是EGFP C1质粒(Clontech, Mountain View, USA)的衍生物,并按照pSuper的描述进行了修改。neo + GFP。将syb2- phluorin质粒中的syb2序列扩增得到syb2- egfp和syb2- mcherry,分别用Bgl II和Bam HI酶切位点克隆到EGFP-C1和mCherry-C1质粒中。采用定点诱变技术获得mCherry-Q67L rab7和T22N rab7突变体。α-Synuclein A53T是通过pcDNA3载体上的野生型α-Synuclein定点突变产生的(P. Dickson,纽卡斯尔大学,澳大利亚)。从VAMP4- phluorin质粒中扩增VAMP4序列,构建VAMP4 L25A-FT,利用Bgl II和Bsh TI酶切位点克隆到pspeed - ft - n1(质粒31912,Addgene)中。从syb2- morange2质粒中扩增syb2序列,利用Xho I和Bam HI酶切位点克隆到pSlow-FT-N1中,构建syb2- ft。从mCer-synaptophysin质粒中扩增synaptophysin序列,并利用Xho I和Sac II酶切位点将其克隆到plow - ft - n1中。利用Bsh TI和Bsp 1407I酶切位点将VAMP4-FT与EGFP交换FT构建VAMP4-EGFP。mCer VAMP4的克隆采用两步法。 First, the FT sequence was removed from the VAMP4-FT plasmid by a polymerase chain reaction–mediated deletion, and mCherry from mCherry N1 plasmid was inserted upstream of VAMP4 using Nhe I and Bgl II restriction sites, creating mCherry VAMP4 plasmid. Then, the VAMP4 sequence from mCherry VAMP4 plasmid was cloned into a mCer C1 plasmid using Bsp 1407I and Bam HI restriction sites. mCer syb2 was constructed by exchanging mCherry from mCherry syb2 with mCer using Bsh TI and Bsp 1407I restriction sites.

抗体gydF4y2Ba

本研究中使用了以下一抗。使用的小鼠抗体针对如下:肌动蛋白[Western blotting (WB), 1:20 000;Sigma-Aldrich、A3854 RRID AB_262011):;AP1γ(ICC 1:3000;世行,1:50 0;生物科学与技术(英文版);PSD95 (ICC, 1:50 0;世行,1:50 0;810401年BioLegend AB_2564750);突触体相关蛋白25 (WB, 1:2000; Synaptic Systems, 111 011, RID:AB_2617076); synaptotagmin 1 (ICC, 1:2000; WB, 1:500; Abcam, ab13259, RRID:AB_299799); syntaxin1 (WB, 1:2000; Synaptic Systems, 110 011, RRID:AB_887844); synapsin 1 (ICC, 1:1000; Synaptic Systems, 106 011C2, RRID:AB_10805139); vesicle transport through interaction with t-SNAREs homolog 1A (WB, 1:10,000; BD Biosciences, 611220, RRID:AB_398752). Rabbit antibodies used were against the following: synaptotagmin 1 lumenal domain (ICC, 1:200; Synaptic Systems, 105103C5, RRID:AB_2619766); SV2A (ICC, 1:1000; Abcam, ab32942, RRID:AB_778192); synaptophysin 1 (WB, 1:1000; Synaptic Systems, 101 002, RRID:AB_1961591); syntaxin6 (WB, 1:1000; Synaptic Systems, 110 062, RRID:AB_887854); syb2 (WB, 1:1000; Abcam, ab3347, RRID:AB_2212462); VAMP4 (WB, 1:1000; Abcam, ab108051, RRID:AB_10862443); VAMP4 (ICC/IHC, 1:1000/1:500; Synaptic Systems, 136002, RRID:AB_887829); CHC (ICC, 1:50; Cell Signaling Technology, 4796, RRID:AB_10828486). The following secondary antibodies were used in this study: donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 (ICC, 1:1000; Thermo Fisher Scientific, A31571, RRID:AB_162542); donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 (ICC, 1:1000; Thermo Fisher Scientific, A10042, RRID:AB_2534017); goat anti-mouse Alexa Fluor 488 (ICC, 1:1000; Thermo Fisher Scientific, A11001, RRID:AB_2534069); goat anti-rabbit Alexa Fluor 647 (ICC, 1:1000; Thermo Fisher Scientific, A21244, RRID:AB_2535812); donkey anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) IRDye 800 CW (WB, 1:10,000; LI-COR, 92532213, RRID:AB_2715510); goat anti-mouse IgG IRDye 800 CW (WB, 1:10,000; LI-COR, 92632210, RRID:AB_621842).

组织培养和转染gydF4y2Ba

原代分离的海马培养物来源于野生型C56BL/6J E17.5(胚日17.5)胚胎gydF4y2BaVamp4.gydF4y2Ba如上所述,KO E17.5胚胎(具有野生型偶体控制)(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。简而言之,在豚霉蛋白磷酸盐缓冲盐水(PBS)的木瓜蛋白酶(10u / ml)中消化分离的海马,在补充有10%胎牛血清(FBS)的最小基本培养基中洗涤,并研磨成单细胞悬浮液。以所需的密度镀在聚 -gydF4y2BadgydF4y2Ba-赖氨酸和层蛋白涂层25毫米直径覆盖。神经元培养在含0.5 mM B-27的Neurobasal培养基中进行gydF4y2BalgydF4y2Ba-Glutamine,和青霉素和链霉素(1%,v / v)。在3 div,培养物补充有1 mm胞嘧啶β-gydF4y2BadgydF4y2Ba-阿拉伯呋喃苷抑制胶质细胞增殖。gydF4y2Ba

大鼠海马培养物由E18.5胚胎制备。通过胰蛋白酶介导的消化和机械研磨来解析海马神经元。神经元s were plated in medium containing 10% FBS (HyClone), 0.45% dextrose, sodium pyruvate (0.11 mg/ml), 2 mM glutamine, penicillin (100 U/ml), and streptomycin (100 mg/ml) in modified Eagle’s medium. Typically, 200,000 neurons were plated on 18-mm coverglasses coated overnight with poly-dgydF4y2Ba-赖氨酸(0.06 mg/ml)和层粘连蛋白(0.0025 mg/ml)在硼酸缓冲液中。4小时后,将神经元切换到含有1× B27、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 mg/ml)、2 mM谷氨酰胺和12.5 μM谷氨酸的Neurobasal培养基中。每4天更换一半培养基。按照制造商的说明,分别用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, 11668-019)在DIV 7和8处转染或共转染海马神经元,并在DIV 13到16处对神经元进行成像,具体描述如下。gydF4y2Ba

慢病毒颗粒的产生和转导gydF4y2Ba

慢病毒粒子产生如下所述(gydF4y2Ba63gydF4y2Ba)。使用Lipofectamine 2000用三种质粒FUP95GW,PSPAX2和P-CMV-VSV-G(摩尔比为P-CMV-VSV-G(摩尔比,2:1:1)转染人胚胎肾293T细胞。用Lipofectamine 2000转染三种质粒FUP95GW,PSPAX2和P-CMV-VSV-G(摩尔比,2:1:1)。将细胞孵育在FBS培养基替换为B27,青霉素和链霉素的神经缺卵剂替换FBS培养基之前,DNA:Lipofectamine 2000混合物8小时在37℃下进行8小时。gydF4y2BalgydF4y2Ba谷氨酰胺。第3天收集含有病毒颗粒的培养基,用0.45-μm滤膜过滤后,直接用于神经细胞在DIV 10上的转导。在DIV 14和15进行培养。gydF4y2Ba

急性切片制备gydF4y2Ba

水平海马切片(350μm)由野生型和Vamp4 KO小鼠制备(25-32天,无论是性别)。切除的大脑迅速转移以冷却(2°至5℃)肉质生成的蔗糖改性的人工脑脊液(Sacsf; 86mm NaCl,1.2mM磷酸钠缓冲液,2.5mm Kcl,25mm Nahco。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,25mm葡萄糖,50mm蔗糖,0.5mm CaClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba、7mm氯化镁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba) 2分钟,然后使用振动切片机(徕卡,VT1200S)在同一溶液中切片。切片在33°C的碳化标准aCSF中恢复1小时,其中包含126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM磷酸钠缓冲液,25 mM NaHCOgydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,15毫米葡萄糖,2 mm caclgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 2 mM氯化镁gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

电生理学gydF4y2Ba

为了记录,将切片转移到连续灌注标准aCSF (1 mM MgClgydF4y2Ba2gydF4y2Ba)使用在线珀耳帖加热器(Scientifica,UK)维持在32°C。在Ca2和Ca1(鉴定为地层杂散的内侧终止)之间进行切割以烧蚀复发活性。使用拉式硼橇电极(4至7megoHMS),从CA1区域中的可视鉴定金字塔神经元进行全细胞贴片夹具。用于诱发的细胞内溶液和固有特性的实验由142mM k-葡萄糖酸盐,4mM KCl,0.5mM EGTA,10mM Hepes,2mM MgCl组成gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,2 mm nagydF4y2Ba2gydF4y2BaATP, 0.3 mM NagydF4y2Ba2gydF4y2BaGTP和10mm NagydF4y2Ba2gydF4y2Ba肌酸。mEPSC记录,使用基于铯的胞内溶液,包括140 mM cs -葡萄糖酸盐,3 mM CsCl, 0.2 mM EGTA, 10 mM Hepes, 5 mM QX-314氯化物,2 mM MgATP, 2 mM NaATP, 0.3 mM NagydF4y2Ba2gydF4y2BaGTP和10mm磷酸肌酸。在picrotoxin (50 μM)存在的情况下,在−70 mV的电压下记录了兴奋电流,并进一步添加了河豚毒素(300 nM)用于mEPSC记录。gydF4y2Ba

在记录协议中,以电流钳位模式记录内部属性。所有其他录音都在电压夹下进行。使用Clampex 10软件(Pclamp 10,Molecular Devices,San Jose,San Jose,San Jose,USA),在3至10kHz下电流低至3至10kHz,并在10至20 kHz下进行采样。对于诱发的录音,Schaffer侧面用填充有ACSF的贴片电极(约1至2兆欧)刺激,并定位在地层辐射元中,连接到分离的恒定电流刺激器(Digitimer,W​​elwyn Garden City,UK)。在所有情况下,将刺激强度设定为在50μs脉冲之后唤起〜200Pa的电流。刺激以配对脉冲(10至500ms,对30秒的间隔)递送,短脉冲串(10 Hz,16个脉冲,16个脉冲分开)或长火车(40Hz,换行4,重复4个重复。4分钟分开)。使用PCLAMP 10软件套件(所有EPSCs)的开源激励软件包(内在属性)或CLAMPFIT脱机分析数据。如果在录制过程中串联电阻在20%以上,则不能分析细胞。gydF4y2Ba

RRP大小及其补充是使用(gydF4y2Ba64gydF4y2Ba)。简单地说,RRP是通过绘制来自40 hz 15 s序列的累积EPSC振幅,并对该图的最后1 s进行线性回归来计算的。的gydF4y2BaygydF4y2Ba回归线截距为RRP大小(图S6D)。补给率用回归线的斜率表示。Pr被计算为第一次诱发EPSC的振幅除以有效RRP的大小(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

ICC,灌注固定和IHCgydF4y2Ba

对于ICC神经元,在室温下用4% PFA和PBS固定4 ~ 5分钟。用10%胎牛血清、0.1%甘氨酸和0.3% Triton X-100 PBS封闭和渗透样品20分钟,并与一抗在4°C孵育过夜。二抗在室温下应用1小时。用FluorSave试剂(Merck Millipore)将盖片安装在载玻片上。免疫荧光强度在直径为1.8 μm的圆形感兴趣区域(ROIs)内进行量化,使用ImageJ中相同的强度阈值自动放置在神经末梢上。gydF4y2Ba

通过将神经元孵育在含有136mM NaCl,2.5mM KCl,2mM CaCl的缓冲液中,通过将具有荧光标记的Syt1 Ab(1:200)孵育的神经元孵育神经元进行活染力(Syt1 Ab吸收)。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,1.3 mm mgclgydF4y2Ba2gydF4y2Ba, 10mm葡萄糖和10mm Hepes (pH 7.4)(成像缓冲液)在37°C下30分钟。为了定量评估,在相应的实验中,对所有coverlips使用相同的抗体溶液。gydF4y2Ba

VAMP4-EGFP和Vamp4-氟化素免疫荧光强度(gydF4y2Ba无花果。4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)用直径1.8 μm的圆形roi进行量化,使用ImageJ中的时间序列分析仪手动放置在神经末梢上。根据轴突乔木的形态,对神经末梢进行了鉴定。gydF4y2Ba

用PSD95-EGFP或内源PSD95分致如下:(i)直径为1.8μm的圆形ROI,在显示积聚的神经终端上置于圆周的圆形ROI。SYP-MOR2,VAMP4-嘌呤素和SYB2-嘌呤素;(ii)通过在所有实验中的不同条件下对PSD95的相同强度阈值施加相同的强度阈值来计算与突触前标记的PSD95旁路数量的数量计算(gydF4y2Ba63gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对于IHC, 3个月大的野生型和VAMP4 KO小鼠,雌雄均给予致命剂量戊巴比妥钠,经心脏灌注冷PB缓冲液,然后是冷PFA(在0.1 M PB中4%)。提取脑组织,4°C PFA中固定24小时,PBS洗涤,转移到30%蔗糖/PBS溶液中4°C下48小时。用组织冷冻剂包埋大脑,用冷冻切片机生成50 μm冠状切片。将自由漂浮的薄片在块液(PBS、10%马血清、0.5%牛血清白蛋白、0.5% Triton X-100和0.2 M甘氨酸)中渗透4 - 5小时,然后与块液(1:500)稀释的VAMP4一抗(之前针对VAMP4 KO组织预先清除)在4°C下孵育过夜。切片在PBS中洗涤4 - 5次2小时,然后用二抗孵育3 - 4小时(1:1000;抗兔Alexa Fluor 568)和NeuroTrace绿色荧光Nissl染色(1:2000;Thermo Fisher Scientific)室温。然后用PBS冲洗4 - 5次,持续2小时,然后使用延长金抗褪色贴片(Thermo Fisher Scientific)安装在玻片上。切片在蔡司LSM800立式共聚焦显微镜上成像。使用Zeiss ZEN软件中的瓷砖功能获取整个区域重叠的图像,然后使用图像处理功能将瓷砖拼接在一起。gydF4y2Ba

TMR-DEXTRAN吸收gydF4y2Ba

如上所述在37℃下进行TMR-DEXTRAN吸收(40kDA)(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba)。用SYT1 AB标记的神经元与TMR-葡聚糖(50μm)一起孵育,溶解在补充有10μMCNQX和50μMPA-5的成像缓冲液中,并用40Hz的400个AP刺激。为了去除非特异性标记,刺激后立即立即洗涤细胞。使用EC计划 - 新荧光40×浸没物镜(数值孔径,1.3)和Colibri 7发光二极管光源(Zeiss),在倒蔡司Axio观察者Z1显微镜上进行神经元的所有活成像。显微镜配有Zeiss Axiocam 506相机,并由Zeiss Zen 2软件控制。使用DSRED(激励器,538至562nm;分束器,570nm;发射器,570至640nm)和Cy5(激励器,625至655 nm;分束器,660NM;发射器,665至715 nm)滤波器集。用于分析,获得每盖玻片的四到五个视野。使用ImageJ中的自写宏确定每个视野的TMR-Dextran Puncta数。宏使用最大熵和分析粒子算法来阈值,并且计数在0.3和2.5μm之间的尖端。 To account for differences in synapse density, the number of TMR-dextran puncta was normalized to the number of synapses labeled with Syt1 Ab (active synapses) in the same fields of view. For quantification, the number of TMR-dextran puncta was averaged per coverslip.

普鲁林和Morange2记者的实时成像gydF4y2Ba

对phorin和syp-mOr2报告者的成像如下所述(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),在37°C时。盖玻片安装在成像室(华纳仪器,USA,RC-21BRF)中,供应嵌入式平行铂电线,相距0.6厘米,用于电刺激。在10Hz的40Hz或300 AP的400 AP(100mA,1-MS脉冲宽度)刺激培养物,在10 Hz。使用GFP(激励器,450至490nm;分束器,495nm;发射器,500至550nm)和DSRED滤波器组成像转染的神经元,并在整个中以2-S间隔捕获的图像。在灌注碱性成像缓冲液(含50mM NH后,可视化氟素的表达池。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在刺激终止后,CL而不是50mM NaCl)180s。该值用于定量突触氟素水平,只有表达普洛林和SYP-Mor2的斑点,选择用于分析。基于其轴突移动性来区分SVS和indolysoSomes。SVS是稳定的细胞器,富含神经末端,其可能或可能不参与响应于电刺激的循环回收,而内体是在轴突中接受前进的膜细胞器,其在轴突中通常不会在电刺激上进行融合。Vamp4-EGFP的成像(gydF4y2Ba无花果。4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)在成像缓冲液中的活神经元中进行,根据轴突的形态识别神经末梢。gydF4y2Ba

为了定量SV池和SV融合量,在1 μM巴菲霉素A1 (Stratech)的存在下进行成像和刺激。在图像采集前和采集期间使用30 μM SMIFH2 (Abcam)处理2小时。用40个APs在20 Hz的刺激触发RRP sv的融合。TRP以20赫兹的频率释放了900个ap。灌注碱性显像缓冲液后,可见总表达氟的SV池。荧光图像采集频率为0.5 Hz。gydF4y2Ba

使用ImageJ的时间序列分析仪插件对延时序列进行量化。对于syp-mOr2和VAMP4/syb2 pHluorin的双色延时序列,在响应的syp-mOr2突触终端上放置roi,并在绿色和红色通道中监测荧光强度的平均变化。为了分析sypHy监测的SV融合程度和SV内吞动力学,只选择对刺激有反应的突触进行分析。在所有实验中,响应终端的标准是响应AP刺激的荧光强度平均增加≥基线的2%。如果需要,使用从同一封面上的无响应终端计算出的漂白因子对痕迹进行漂白校正。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism 8进行统计分析。gydF4y2Ba

FTS的成像gydF4y2Ba

用Vamp4-Ft,SyB2-Ft和Sypaptophysin-FT转染的神经元的实时成像在转染后7天的第37℃下在37℃下进行。使用DSRED和定时器滤波器组(激发波长,370至400nm;分束器,405nm;发射器,425至525nm)进行成像。在红色通道中首先获取图像,然后在蓝色通道中获取(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。在置于突触末端的ROI中测量蓝色和红色免疫荧光强度及其在减法后计算荧光后的比率。gydF4y2Ba

成像的iGluSnFRgydF4y2Ba

使用GFP(激励器,450至490nm;分束器,495nm;发射器,500至550nm)过滤器进行IGLUSNFR的成像,设置在37°C中。每5秒刺激培养物,其中5个AP的5个连续列表(20 Hz)。每0.3秒获取荧光图像。使用时间序列分析仪插件进行ImageJ的时间流逝系列的量化,如普洛林成像所描述的。gydF4y2Ba

这部电影成像gydF4y2Ba

用Mor-Vamp4或Mcor-Syb2和YFP-综合组合的神经元的实时Flim成像(单独用作阴性对照)的成像缓冲液中,以10μmCNQx和50μmP-5的成像缓冲液中进行。在Leica SP8 Falcon上获取FLIM图像,由LAS X v的集成的FLIM共用平台进行。3.5.2.18963软件配备了440nm脉冲激光(PicoQuant PDL 800-D脉冲二极管激光)和HYD单分子检测探测器。所有实验都使用了脉冲激光和探测器设置的相同强度。使用HC PL APO CS2 63×/ 1.40油目的进行图像。用于图像采集的共焦设置如下:512乘512×512像素的显示分辨率,8位动态范围,3.0的光学变焦,导致最终像素大小为0.12μm。在帧上应用四个时间线平均,扫描速度为400 Hz。使用440nm脉冲激光器用于激发Mcor,并且在451至520nm的范围内检测到荧光信号。选择含有十几个突触终端的感兴趣区域,在休息时获得单个FLIM图像。然后触发40 Hz的800个AP的火车,然后触发离线。在刺激发作后,拍摄了相同感兴趣区域的第二个FLIM图像,在图像采集期间连续刺激神经元。 The instrument response function for the data analysis was obtained by FLIM imaging of a gold nanorod sample at the excitation wavelength. All FLIM images were exported in a PTU format using the LAS X software and analyzed offline with FLIMfit 5.1.1 (freely available athttps://downloads.openmicroscopy.org/flimfit/4.11.0/gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

对于分析,使用Flimfit中的分段工具创建突触ROI。将相同的ROI应用于在静止(控制)和现场刺激期间获得的脱裂图像。为了计算供体的荧光寿命(衰减时间摩苏τ),我们施加了在褶皱中可用的像素 - 明智的全局拟合方法,并将供体荧光强度衰减沉积到双指数衰减模型[方程1,3和5中(gydF4y2Ba65gydF4y2Ba)]。适合的质量标准由χ定义gydF4y2Ba2gydF4y2Ba值接近1。实验结果表明,控制和刺激样品间的FRET效率差异为:ΔFRET = τ1 mCer_control−τ1 mCer_stimulated。伪彩色生存期图像及匹配直方图(gydF4y2Ba图2,A ~ HgydF4y2Ba),并在3.0到4.1 ns以上显示,如图表所示。gydF4y2Ba

图2中的图像。使用Zeiss Plan-Apochomat 40×Oper目标在倒的蔡司Axio观察者A1显微镜上获得S2G。使用475至525nm的激发可视化YFP-综合症1A,而使用416至456nm激发可视化Mor-Syb2和Mcor-Vamp4。两者都是使用515-nm横梁和505至560nm发射的可视化。gydF4y2Ba

轴突贩运和脑电图分析的延时成像gydF4y2Ba

转染VAMP4-EGFP或syb2-EGFP或mchery -rab7的神经元(DIV 13 ~ 15)在37°C成像缓冲液中进行延时成像。一组帧(共120帧;帧间隔1.4 s;在基础条件下,获得了总时间间隔(2.8 min)来观察轴突贩运。随后,在40赫兹下用400个APs刺激神经元,并在刺激期间和刺激后持续监测轴突载体的运动。gydF4y2Ba

使用用于imagej的kymoormarclear宏工具集生成录影仪(gydF4y2Ba66gydF4y2Ba)。每个盖玻片追踪120至140μm的单个远端轴突段。使用kymogrlear的分段线工具手动构建移动颗粒的轨迹。每个轴突的固定载体的数量使用kymographdirect中的相同强度阈值自动计算(gydF4y2Ba66gydF4y2Ba)。顺行和逆行移动载体的数量以相应轴突节段内固定+移动载体总数的百分比进行量化。使用KymographDirect从波形图中提取移动载波的运行长度。VAMP4-EGFP和syb2-EGFP携带者与mCherry-rab7共同贩运的百分比由脉动仪手动计算。gydF4y2Ba

用HRP和电子显微镜标记内吞途径gydF4y2Ba

海马培养用成像缓冲液清洗一次,然后在HRP (10 mg/ml成像缓冲液)的存在下,用400个APs的序列在10秒内进行刺激。HRP洗脱后,培养物立即在0.1 M PB中2%戊二醛和2%多聚甲醛中固定,37°C 30分钟。在初始成像介质清洗后立即固定未刺激和未标记的培养物,以测量基线SV池大小。用0.1 M PB洗涤后,培养物暴露于0.1%二氨基联苯胺和0.2% HgydF4y2Ba2gydF4y2BaOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba在0.1 M PB中直到颜色显现。培养物用0.1 M PB洗涤,1%四氧化锇在室温下染色30分钟。在水洗涤后,培养物使用乙醇系列和最后两个聚丙烯氧化步骤脱水,然后嵌入Durcupan树脂。样品切片,装在formvar网格上,用醋酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。切片用JEOL TEM-1400 Plus透射电子显微镜观察。对神经末梢进行成像和分析,只要它们是膜结合的,并且包含一池的sv,无论它们是否包含辣根过氧化物酶。直径<100 nm的细胞内结构被任意指定为sv,而较大的结构被认为是核内体。使用ImageJ手工计算每个神经末梢内hrp标记的神经静息度和核内体。gydF4y2Ba

蛋白质生物化学gydF4y2Ba

原油突触体(P2)由年龄匹配的野生型和Vamp4 KO小鼠的大脑制备。在Tris缓冲蔗糖[0.32μm蔗糖,1mM EDTA和5mm Tris(pH7.4)中制备脑匀浆,并在1075离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟颗粒核馏分(P1)。接下来,将上清液以20,200离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟颗粒颗粒粗突触体。将P2颗粒(来自个体鼠标大脑)重悬于20ml的HEPES缓冲克雷布(118.5mM NaCl,4.7mm Kcl,1.18mM MgSO中gydF4y2Ba4gydF4y2Ba, 10mm葡萄糖,1mm磷酸钠缓冲液和20mm Hepes),在20,200下重新离心gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟。吸出上清液,将粒料冷冻以供随后使用。gydF4y2Ba

为了定量使用Wb的蛋白质表达,在含有25mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,1mM EGTA,1mM EDTA,1%Triton X-100和1×蛋白酶抑制剂鸡尾酒的缓冲液中裂解突触体。将SDS样品缓冲液[67mm TRIS(pH7.4),2mM EGTA,9.3%甘油,12%β-巯基乙醇,溴苯酚蓝和67mM SDS]加入到裂解物中,并在分离之前将样品煮沸10分钟SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)。gydF4y2Ba

通过在含有25mM Tris-HCl(pH7.4),150mM NaCl,1%NP-40,0.1%SDS,0.5%脱氧胆酸,1mM EDTA,1mM EGTA和1的缓冲液中通过均化制备脑裂解物。×蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在冰上孵育30分钟的同时涡旋六次样品。离心除去细胞碎片(10,000gydF4y2BaggydF4y2Ba取上清液(全脑裂解液)用2× SDS样品缓冲液稀释,煮沸10 min,上清液上SDS- page。gydF4y2Ba

通过在三缓冲蔗糖中重悬和均质P2突触体制备裂解液颗粒2 (LP2)馏分。在此之后,在4°C下向悬液中加入1 M Hepes/NaOH溶液(pH 7.4)。悬浮液在25000℃下离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下20分钟,给予LP1和裂解物上清液(LS1)。LS1以165,000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba,得到LP2和LS2的分数。LP2在0.4 M蔗糖中重悬。gydF4y2Ba

在SDS-PAGE上溶解蛋白质样品并将其涂在硝酸纤维素膜上。将膜与初级抗体一起在4℃下孵育过夜,并在室温下用二抗1小时。使用Li-Cor Image Studio Lite软件(版本5.2)并使用imagej进行分析,在Odyssey 9120红外成像系统(Li-Cor Biosciences)上成像。在蛋白表达带周围设定的相同尺寸的矩形ROI测量信号的集成密度。gydF4y2Ba

蛋白质组学样品制备gydF4y2Ba

突触体样品在−20°C下丙酮沉淀6小时,球团用冷冻丙酮洗涤。球团风干后在尿素裂解缓冲液中溶解(8 M尿素在50 mM tris-Cl和1%脱氧胆酸钠中)。所有样品的蛋白质浓度均采用双铬酸测定法(Thermo Fisher Scientific)测定。用悬浮诱捕(S-Trap)法制备蛋白质组学样品(gydF4y2Ba67gydF4y2Ba),按供应商(Plotifi,Huntington,Ny,USA)的推荐。用5mM Tris(2-羧乙基)膦(Pierce)在37℃下将样品减少30分钟,随后在37℃下用5mM碘乙酰胺烷基化30分钟。在还原和烷基化后,用2.5μl12%磷酸酸化样品,并通过加入165μl的S-Trap结合缓冲液[90%甲醇在100mM三乙基碳酸氢铵缓冲液(pH7.1)中制备蛋白水解。将酸化样品加入到S-Trap MicroSpin柱中并以4000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟。将每个S-Trap MicroSpin柱用150μl的S-Trap结合缓冲液洗涤,并在4000处离心gydF4y2BaggydF4y2Ba1分钟。重复该过程5次洗涤。将25微升的50 mm Teab(pH8.0)含有序列级胰蛋白酶(1:10的胰蛋白酶:蛋白质的比率)加入每个样品中,然后使用热敏剂(Eppendorf)在47℃下进行2小时的蛋白水解。用50mM茶(pH8.0)洗脱肽,并以1000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba分别用0.2%甲酸(FA)和0.2% FA在50%乙腈中重复洗脱步骤。每个样品的联合洗脱液在−80°C储存前用SpeedVac干燥。gydF4y2Ba

液相色谱 - 串联质谱分析gydF4y2Ba

将肽以20μl0.1%的Fa,涡旋和超声处理重构,并在质谱仪上注射1.5μl的每个样品。使用含有嵌合融合腔三纤维质谱仪(Thermo Fisher Sciencific)通过耦合到Dionex Ultimate RSLC 3000系统的纳米玻璃LC-MS / MS(液相色谱 - 串联质谱)分析肽。将样品注入100μm内径×5mm陷阱(Thermo Trap盒,5mm)上并在75μm-×50cm纳米LC柱上分离(易喷雾LC柱,#ES803)。使用的所有溶剂是高效液相色谱或LC-MS等级(Millipore)。使用0.1%Fa和2%乙腈在水中以10μl/ min装载5分钟的肽。使用100%缓冲液A [0.1%Fa和3%二甲基亚砜(DMSO)在水中调节柱,并在0至35%缓冲液B(0.1%Fa,3%DMSO,在300 nl / min的3000分钟内超过120%的水和80%乙腈。然后用90%缓冲液B洗涤柱5分钟并用100%缓冲液A平衡10分钟,以制备下一分析。全文扫描从质量/充电比率获得(gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba),分辨率为12万gydF4y2Bam / z.gydF4y2Ba200,目标自动增益控制4×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba最大注射时间为50毫秒。MS/MS扫描在IonTrap模式下获得,使用Top 20方法,固定的高能碰撞解离能为30%,分辨率为15,000,目标AGC为2 × 10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba最大注射时间为50毫秒。MS/MS触发阈值设置为5 × 10gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,动态排除先前获得的前体45 s。gydF4y2Ba

蛋白质组学数据分析gydF4y2Ba

肽段鉴定通过将原始数据提交到MaxQuant软件(版本1.6.6.0)进行。在Uniprot SwissProt数据库中搜索MS/MS谱,包括isoforms(2019年1月更新),错误发现率为1%。用胰蛋白酶/P酶将缺失的最大裂解量设为2。氨甲酰化(C)为固定修饰,乙酰化(蛋白N项)、氧化(M)、脱氨(NQ)为可变修饰。使用匹配窗口时间(0.7)和对齐时间窗口(20分钟)进行无标签定量。使用Student’s进行组间比较gydF4y2BatgydF4y2Ba使用A测试gydF4y2BaPgydF4y2Ba使用Perseus软件(1.6.6.0版)截断的值(<0.05)。的gydF4y2BaPgydF4y2Ba通过施加1.5的折叠变化,将值显着的蛋白质过滤用于差异表达的蛋白质。使用Enrichr进行差异表达的蛋白质进行生物信息分析(gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba)用于丰富的软件。原始蛋白质组学数据沉积在骄傲上(gydF4y2Bawww.ebi.ac.uk骄傲/gydF4y2Ba;pxd021437 -通过靶向内溶酶体的VAMP4控制突触囊泡PR)。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

GraphPad Prism 8.4.3进行统计学分析。未采用统计学方法预先确定样本量,也未采用随机化程序。数据集的分布采用D’agostino - pearson正态性检验进行统计检验。正态分布数据以均数或均数±SEM表示,而非高斯数据集以中位数±四分位数范围表示。显著性设为不显著gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05,*gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05,* *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01,* * *gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001,和****gydF4y2BaPgydF4y2Ba<0.0001。Mann-Whitney(双尾),Wilcoxon匹配对签名 - 等级(双尾)和kruskal-wallis使用Dunn的后Hoc测试用于比较非高斯数据集。学生们gydF4y2BatgydF4y2Ba测试(双尾)和方差分析(ANOVAS),然后是Tukey的后HOC测试进行比较正常分布的数据集。双向ANOVA用于确定适当的多群比较的基因型效应和相互作用。有关样本尺寸的信息,用于计算的统计测试gydF4y2BaPgydF4y2Ba值,结果的数值在图图例和表S2中指定。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料可供选择gydF4y2Ba//www.messagestyle.com/cgi/content/full/7/18/eabf3873/DC1gydF4y2Ba

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这是一个在术语条款下分发的开放式文章gydF4y2Ba创意公共归因许可证gydF4y2Ba,允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制,只要原稿被适当引用。gydF4y2Ba

参考和笔记gydF4y2Ba

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致谢:gydF4y2Ba我们感谢S. Gordon, A. Kokotos和C. Harper提供了特异性表达质粒,感谢C. Kontaxi提供了用于蛋白质分布分析的LP2样本。感谢S. Mitchell为我们提供的优秀技术支持;H. Runciman和A. T. Lopes分别制备小鼠和大鼠海马培养物;以及来自克里克先进光学显微镜设备(CALM)的R. D . antuono和K. I. Anderson协助FLIM成像和分析。gydF4y2Ba资金:gydF4y2Ba这项研究全部或部分资助了Wellcome Trust [调查员奖到M.A.c..(204954 / z / 16 / z)和惠康信托多用户设备授予(212947 / z / 18 / z)到m.t.]。出于开放访问的目的,我们已将CC-By Public版权许可证应用于此提交所产生的任何作者接受的稿件版本。这项工作也得到了D.I的麦克唐纳籽基金奖的支持。S.K.U.Francis Crick Institute的支持,该研究所从癌症研究英国(FC001201),U.K.医学研究理事会(FC001201)和Wellcome Trust(FC001201)中获得核心资金。gydF4y2Ba作者捐款:gydF4y2Ba概念化:D.I.和m.a.c。方法论:D.I.,K.L.D.,A.G.,E.C.D.,M.T.和M.A.C.正式分析:D.I.,K.L.D.,A.G.,E.C.D.和D.H.调查:D.I.,K.L.D.,A.G.,E.C.D.,D.H.和M.A.C.资源:M.A.C.,M.T.和S.K.u。写作原稿草案:D.I.和m.a.c。写作审查和编辑:所有作者。资金收购:M.A.C.,M.T.,S.K.U.和D.I.gydF4y2Ba利益争夺:gydF4y2Ba提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba数据和材料可用性:gydF4y2Ba评价论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充资料中。可能要求作者提供与本文相关的其他数据。gydF4y2Ba

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