研究文章 癌症

单细胞分析显示脑肿瘤中有效的siRNA递送,具有微泡增强的超声和阳离子纳米颗粒

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十搏欧洲杯直播官网2021年4月30日:
卷。7,不。18,EABF7390.
DOI:10.1126 / sciadv.abf7390

抽象的

基于RNA的疗法为治疗脑肿瘤提供独特的优势。然而,肿瘤渗透和吸收受RNA治疗尺寸,电荷,并且需要在大型载体中“包装”以提高生物利用度。在此,我们已经检查了SiRNA的递送,包装在50nm阳离子脂质 - 聚合物杂交纳米粒子(LPHS:siRNA)中,与小儿和成年临床前脑肿瘤模型中的微泡增强聚焦超声(MB-FU)联合。使用单细胞图像分析,我们表明MB-FU与LPH组合:siRNA导致SiRNA递送10倍以上的两个模型的脑肿瘤微环境。MB-Fus递送平滑(smo.)针对siRNA减少smo.蛋白质产生并显着增加肿瘤细胞死亡smo.-Activated medulloblastoma模型。此外,我们的分析表明,Mb-Fus和纳米颗粒性能可以优化以最大化脑肿瘤微环境中的递送,从而用作开发下一代可调输送系统的平台,用于脑肿瘤中的基于RNA的疗法。

介绍

使用RNA干扰的基于RNA的治疗,包括小干扰和短发夹RNA (siRNA/shRNA)、作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)和CRISPR RNA (12),可以设计为选择性地靶向核心肿瘤信号传导途径(3.)。虽然微创的RNA向颅内恶性肿瘤进行全身侵入性质,但与常规侵入性方法(例如,OMMANA水库)提供了几个优势(4.),有效的交付仍然是一个重大挑战。这在一定程度上是由于生物液体中未修饰的核酸的降解,大脑积聚不良,以及癌细胞摄取或从内吞体脂质双层屏障逃逸的不良(3.5.6.)。虽然将RNA掺入纳米颗粒可以延长循环时间并促进细胞摄取(27.),其在脑肿瘤微环境(TME)中的积累仍然特别差(8.9.)由于血脑/血液肿瘤屏障的纳米颗粒渗透率低(BBB / BTB)(10.)及有限的间隙运输(11.)。同时超越这些速率限制因素的要求,这始终如时阻碍对原发性脑肿瘤的临床有效的纳米疗作用(12.-15.),强调需要安全和更强大的基于RNA的药物交付策略。

低强度聚焦超声(FUS)与超声(血管)造影剂相结合,称为“微泡”(MBS)提供了物理方法,以瞬时调节脑TME并改善大脑中抗癌剂的递送(16.17.)。最近的临床试验已经证明了MB-FUS的安全性,并提供了使用小剂量化疗药物(18.-21.)。虽然脑TME中的改善药物递送主要归因于BBB / BTB渗透性的瞬态变化(16.22.),最近的研究已经提到了MB-Fus的能力,也增加了脑TME中的间质液流量(23.)。这些观察既解释了也强调了它在改善脑肿瘤治疗性纳米颗粒递送方面的潜力(24.-31.),包括DNA(Luciferase质粒) - 加载纳米颗粒(32.)。尽管迄今为止所有的研究都使用了50至100纳米的多分散阴离子(表面电荷为- 25至- 5毫伏)纳米颗粒,但仍然不清楚如何最好地结合这些技术。此外,目前还缺乏证据表明在脑肿瘤的细胞腔内选择性和有效地递送纳米颗粒及其负载(包括RNA),这是证明成功递送所需的(33.34.)。结果,尚未建立脑TME中BBB / BTB渗透性,纳米粒子渗透性,纳米粒子性能和摄取的变化的关系,以及脑TME中的肿瘤细胞死亡(即有效核酸基治疗递送)。

我们假设阳离子纳米粒子延长RNA循环和增强细胞摄取与MB-FU的综合能力,以减轻血管和间质障碍的运输可能导致脑肿瘤中RNA治疗的全身递送的稳健策略。在这里,我们通过制造和评估荧光标记的脂质 - 聚合物杂交(LPH)纳米颗粒的Mb-Fus递送与试验siRNA(roHB-LPH加载的Cy5-siRNA,LPH:Cy5-siRNA)和a来测试该假设来测试该假设。治疗霜(smo.)靶向siRNA(LPH:smo.-SiRNA)在胶质瘤和Medulloblastoma的临床前模型,分别是成人和儿童中最常见的恶性脑肿瘤。这smo.-sirna靶向smo.- 激活的声音刺猬(SHH)髓质母细胞瘤的亚组(35.)。随后,我们调查所提出的治疗策略的能力,通过直接评估洛克和洛克和患者,同时超越速率限制因素的速率限制因素smo.使用单细胞图像分析脑TME中脑TME中凋亡途径的递送和激活。最后,通过组合定量的成像和数学建模,我们评估和量化拟议的策略的每一步,并建立对脑肿瘤进行RNA治疗学的设计规则。

结果

MB-Fus介导LPH的增强渗透性:免疫活性小鼠脑中的siRNA纳米颗粒

在本研究中,制备靶向脑TME的siRNA纳米颗粒的基本设计规格由大脑细胞外空间的中位尺寸(孔径:30至60 nm) (36.)以及有证据表明带正电荷的纳米族种质(> + 5mV)显示出高流体血管通量和细胞摄取(27.37.)。考虑到这一点,我们制造了阳离子(表面电荷> +10mV)LPH纳米粒子(38.)中位数为40 nm。该纳米粒子技术可伸缩,产生具有窄尺寸分布的纳米颗粒,可用于提供各种治疗化合物(39.)。我们使用旋转的微径反应器用罗丹明B(Rhob-LPH)制造LPH纳米颗粒,并用Nontargeting Cy5-siRNA(5:1,W / W)加载它们。在Cy5-siRNA负载后,中值粒度从40〜50nm增加,表面电荷从+ 26降低到+11 mV(图1,A和B.和图S1,A和B)。这些尺寸和充电的变化使我们的设计规格(> +5mV和≤60nm)内的LPH:siRNA复合物,同时保持窄尺寸分布。孵育双标记的LPH:SiRNA用鼠GL261胶质瘤癌细胞显示出显着的LPH:siRNA复合吸收,细胞活力高于95%(图1,c至e)。

图。1 装载siRNA的阳离子脂质聚合物杂化纳米颗粒的细胞和血管(BBB)穿透的体外和体内特性。

一种)阳离子LPH和LPH的尺寸分布和形态:Cy5-siRNA纳米粒子。(B.)阳离子(猫)LPH和LPH:Cy5-siRNA的表面电荷。P.由未配对确定的值T.测试。(C)荧光显微镜定量GL261胶质瘤细胞对LPH和Cy5-siRNA的摄取。P.通过对方差的单向分析(ANOVA)确定值。(D.)在体外细胞摄取动力学阳离子LPH:Cy5-siRNA进入GL261胶质瘤细胞。(E.LPH后2小时和8小时的活细胞和死细胞染色:Cy5-siRNA暴露。(F)体内实验方案,用于在健康,免疫紊乱小鼠脑中递送阳离子溶蛾。INSET:MB-FU后代表对比度增强的T1加权MR图像。I.v.,静脉内。(G)在LPH施用非Fus区域(顶部)和保险处理区域(底部)后10分钟在健康小鼠脑中血液荧光显微镜数据的代表性荧光显微镜数据。(H)治疗10 min后,非fus处理区和fus处理区LPH外渗定量(12倍;P.<0.0001,未配对T.测试)。(一世)在LPH给药后10分钟的代表性H&E染色图像。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。****P.≤0.0001。

在制备LPH纳米粒子之后,我们评估了它们在健康小鼠的脑中积累,而不应用MB-Fus。为了考虑免疫相关的反应和纳米颗粒清除,在本研究中,我们使用C57BL / 6J免疫活性小鼠进行体内实验(40)。我们的实验方案,使用定制磁共振引导FUS(MRGFUS)系统总结在图。1F.。对于这些调查,我们使用(i)具有标准曝光设定的0.5MHz传感器(10-MS爆发,每1秒,每1分钟,在水中为475-KPA峰值负压),(ii)OPTISON(GE Healthcare)用10μl/ kg的剂量为100μl/ kg,(iii)rhob-lph纳米颗粒(5mg / kg)。纳米粒子的体内剂量根据先前研究中使用的剂量来确定,所述研究表明该纳米颗粒剂量导致副作用最小(41.-43.)。松开后,切除脑的荧光成像10分钟表示与非FUS区域相比,在FUS处理区域中的LPH外渗液相12倍(P.<0.0001)(图1,g和h)。值得注意的是,对比增强磁共振成像(MRI)既能确认MB-FUS所瞄准的区域,又能跟踪LPH外渗(图。1F.,插图),可能提供一种非侵入性的方式来预测LPH递送和分布。通过测量免疫活性小鼠的血液中阳离子洛克的强度(C57BL / 6J小鼠),我们估计了消除半衰期(T.1/2) 30min(图S1C)。这些初步结果表明,核酸在装载到阳离子LPH (44.)。最后,免疫活性小鼠脑切片的组织学分析表明,FUS靶向脑区域中的阳离子LPH输送不会导致显着的血毒素和曙红(H&E) - 相似的不利影响(图。1I.)。综上所述,这些数据表明MB-FUS可以显著改善阳离子纳米颗粒在免疫活性小鼠fus靶向脑区的递送(>10倍),且没有明显的副作用。

MB-Fus促进阳离子LPH:Cy5-siRNA外渗,渗透和摄取在GL261原位脑肿瘤中

在使用MB-Fus的健康大脑中成功和稳健地递送LPH纳米粒子,我们评估了在脑肿瘤中递送了Nontargeting Cy5-siRNA-SiRNA LPH复合物。在这里,我们使用了已建立的原位GL261胶质瘤同胞鼠模型,其中GL261胶质瘤细胞在C57BL / 6J小鼠中注射甲虫(肿瘤的位置如图3所示)。肿瘤植入后十四天,我们通过我们的MRGFUS系统和与健康小鼠用途相同的暴露设置和方案来超声处理四个非诱导区域以覆盖整个肿瘤(图2A)。荧光显微镜显示,与对照组相比,fus治疗的肿瘤中LPH积累增加了5倍(P.= 0.032) (图2,b到d)。与健康大脑相比,它还表现出观察到的积累的变化较高,这与脑TME的异质性质一致。

图2 使用MB-Fus改善GL261胶质瘤小鼠肿瘤中的阳离子溶解液相传。

一种)在GL261胶质瘤小鼠肿瘤模型中递送阳离子LPH的体内实验方案。在LPH给药后10分钟分析溶液分布。(B.)MB-Fus治疗前后的代表性对比增强T1加权MR图像。(C)在处理后10分钟(5.4倍,P.= 0.032)。(D.)在LPH给药后10分钟的肿瘤中催眠荧光显微镜数据的代表性荧光显微镜数据。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。P.由未配对确定的值T.测试。*P.≤0.05。

在单独的队列中,我们施用LPH:siRNA纳米颗粒并在给药后8小时处死2只小鼠(而不是10分钟)(图3A)。这一时间点是由我们的体外调查决定,其显示出稳健的LPH:通过GL261胶质瘤细胞的siRNA吸收(图1,C, D)。荧光显微镜表明,与非Fus处理的肿瘤相比,Fus靶向肿瘤中的LPH积累的增加13倍,相比(P.= 0.044) (图3,B和C)。至关重要的是,与对照相比,MB-FU后SiRNA摄取量增加了10倍的增加(P.= 0.0364)(图3,E和G和图S3),证明洛克和siRNA递送彼此非常好(即,可靠的siRNA装载)。此外,与对照LPH相比,观察到的递送的改善也伴随着siRNA渗透的五倍增加(仅限SiRNA)(P.= 0.0045)(图3,B, D)。高达60%的LPH:siRNA纳米颗粒被所有类型的细胞[4 ',6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)阳性细胞]中的癌细胞(f - luc阳性细胞)所吸收(图3,f和g),表明GL261-Luc2胶质瘤癌细胞具有良好的摄取能力。综上所述,上述实验数据表明,50 nm阳离子LPH:siRNA纳米颗粒和MB-FUS结合后,siRNA在脑TME中的递送能力显著改善(即10倍)。

图3. 利用MB-Fus改善阳离子LPH:SiRNA外渗,渗透和细胞摄取,使用MB-FUS,GL261胶质瘤小鼠肿瘤。

一种)在LPH的体内实验方案中,在GL261胶质瘤小鼠肿瘤模型中递送siRNA递送。LPH:在纳米粒子给药后8小时分析siRNA分布。(B.)在LPH的8小时后8小时内催眠的代表性荧光显微镜数据:siRNA外渗和肿瘤渗透:siRNA给药。(C)在治疗后8小时内与肿瘤的液体溶液的定量(13.7倍,P.= 0.044)。(D.)在治疗后8小时内与肿瘤的肿瘤渗透到肿瘤中的siRNA渗透(5.4倍,P.= 0.0045)。(E.)在处理后8小时(9.5倍,P.= 0.0364)。(F)定量LPH(蓝色)和CY5-siRNA(红色)将在FUS处理后8小时内输送到癌细胞的总细胞摄取的比例。(G)在LPH的8小时后8小时在肿瘤中的代表性荧光显微镜数据:肿瘤中的CY5-siRNA摄影:siRNA给药。绿色箭头显示LPH:癌细胞的siRNA吸收,白色箭头显示脑细胞的LPH:siRNA摄取。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。P.由未配对确定的值T.测试。*P.≤0.05和**P.≤0.01

MB-FU促进LPH:smo.- 递送,显着减少肿瘤smo.蛋白质表达,并诱导Shh活化的Medulloblastoma的有效和特异性细胞凋亡

为了评估脑TME中提出的治疗策略的鲁棒性和有效性,我们装载了治疗方法smo.-SiRNA至40nm阳离子rhob-lph。该siRNA已经在体外验证(45.)。这个siRNA现在用于抑制smo.-Activated的SHH信号通路,其代表SHH激活瘤的SHH激活亚组(METOROD2:SMOA1-绿色荧光蛋白(GFP)小鼠的转基因小鼠模型中,表达在小脑颗粒神经元前体中表达组成型活化的SMO和GFP报告者细胞;肿瘤的位置如图1所示。S6],具有完整的BBB(46.)。确保smo.-SiRNA保持完全功能,我们没有用荧光分子标记它;因此,我们使用原位杂交(鱼类)测定的荧光评估其离体分布。该测定可以在亚细胞分辨率下检测和定位单个RNA分子(47.48.),从而允许确认存在smo.-SiRNA在脑TME中。对于这些动物的实验,我们使用了定制的便携式超声引导FUS(USGFU)系统(图4A图S4A),并采用如图所示的实验方案图4D。该系统允许Subsilimeter精度瞄准,并且通过超声处理期间通过MB声发射的被动检测实时监测MB动态。我们的测量表明,在超声询问期间,宽带低于1%(2040个)宽带排放量的强谐波排放(最多22 dB),这表明我们的曝光设置在MB-Fus的安全水平范围内(图4,B和C和图S4,B到e)。超声处理后,我们立即管理LPH:smo.-SiRNA并在给药后30小时牺牲小鼠。此时间点是关于所需时间的保守估计smo.敲低点和细胞凋亡的指示(49.)。与胶质瘤肿瘤中的液晶显示:Cy5-siRNA递送一样,与非Fus处理的肿瘤相比,我们发现Fus靶向肿瘤中的LPH积累增加了10倍,相比(P.= 0.0472;图4,E和F和图S7)。确认观察到的rhob-lph递送导致smo.- 在Medulloblastoma细胞中递送,我们进行了鱼。如图所示图4G.,鱼测定证实了卵泡 - 溶蛾和未标记的siRNA在Medulloblastoma细胞(GFP阳性细胞)中的分致化。这些数据在一起表明了拟议策略的稳健性,并确认了成功的交付smo.-SiRNA在Medulloblastoma癌细胞中。

Fig. 4 Enhanced delivery of siRNA into the SHH-activated medulloblastoma tumor using MB-FUS and cationic LPH:SMO-siRNA.

(A) In vivo experiment setup using a custom-built USgFUS system (left). Schematic graph is created with BioRender.com. Representative contrast-enhanced T2-weighted MR images of medulloblastoma tumor–bearing mice (right, top) and contrast-enhanced T1-weighted MR images of healthy mice after FUS BBB disruption (BBBD) targeted at the location of medulloblastoma tumor (right, bottom). (B) Harmonic emission from the MB-mediated BTB disruption using FUS. (C) Quantification of the acoustic emissions. (D) In vivo experimental protocol for the delivery of cationic LPH:SMO-siRNA in a medulloblastoma mouse tumor model. (E) Representative fluorescent microscopy data of LPH accumulation in tumor for non–FUS-treated group (left) and FUS-treated group (right). (F) Quantification of the LPH accumulation in tumor with and without FUS at 30 hours after treatment (9.4-fold, P = 0.0472). (G) Representative fluorescent data of FISH assay on non–MB-FUS group (top) and MB-FUS group (bottom). Plots show means ± SEM (N = 3). P values were determined by unpaired t tests. n.s., no statistical significance; *P ≤ 0.05; ****P ≤ 0.0001.

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图4. 使用MB-FUS和阳离子LPH增强siRNA进入shh激活的成神经管细胞瘤肿瘤:smo.-sirna。

一种)使用自定义USGFUS系统(左)的Vivo实验设置。模拟图是创建的biorender.com。代表性对比 - 增强的T2加权MR图像的Medulloblastoma肿瘤的小鼠(右,顶部)和对比度增强的T1加权T1加权MR图像在Fus BBB中断(BBBD)靶向Medulloblastoma肿瘤(右侧,底部)。(B.)使用FUS的MB介导的BTB中断的谐波发射。(C)声发射的量化。(D.)在体内阳离子LPH提供的实验方案:smo.-SiRNA在Medulloblastoma小鼠肿瘤模型中。(E.)非fus治疗组(左)和fus治疗组(右)肿瘤中LPH积累的代表性荧光显微镜数据。(F)在治疗后30小时的肿瘤中的肿瘤中溶液积聚的定量(9.4倍,P.= 0.0472)。(G)非MB-FUS(顶部)和MB-FUS组(底部)上的鱼类测定的代表性荧光数据。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。P.由未配对确定的值T.测试。N.S.,没有统计学意义;*P.≤0.05;****P.≤0.0001。

下一步,我们评估递送治疗性siRNA是否能诱导smo.击倒和促进Medulloblastoma脑肿瘤中细胞凋亡(图5A)。免疫组织化学揭示了组成型活化的表达smo.在这款Shh Medulloblastoma模型中推动SHH信号通路和肿瘤引发的蛋白质,表明有效smo.击倒 (图5,B和C.)。使用免疫荧光染色,与非Fus处理的肿瘤相比,在MB-Fus处理的肿瘤中检测到肿瘤细胞凋亡增加16倍,相比(P.= 0.0013;图5,D和E)。重要的是,凋亡细胞[末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸刻痕末端标记(TUNEL)阳性]与RhoB-LPH纳米粒子共定位,表明smo.-SiRNA递送导致癌细胞死亡(图5D)。为了确认观察到的细胞凋亡与rhoB-LPS毒性无关,我们分析了GL261胶质母细胞瘤肿瘤,在其中我们递送了Nontargeting Cy5-siRNA,并在8中发现了Fus处理的肿瘤和非保险肿瘤之间的相当水平的细胞凋亡LPH后的小时数:Cy5-siRNA纳米粒子施用(图5 F和G)。对于这些分析,我们通过进行切割的Caspase-3(CC3)染色来验证了用于检测细胞凋亡的TUNEL方法,因为与TUNEL染色相比,它提供了更具体的细胞凋亡的指示,这可能反映其他DNA损伤的其他方法。统称,我们的数据支持与阳离子LPH组合MB-FU的假设:siRNA可以克服将siRNA治疗剂递送给原发性脑肿瘤的障碍,从而有效地靶向驱动原发性脑肿瘤的癌基因。

Fig. 5 MB-FUS, in combination with cationic LPH:SMO-siRNA, induces cell apoptosis in SHH-activated subgroup of medulloblastoma.

(A) Schematic illustration of LPH:siRNA-induced cell apoptosis. Schematic graph is created with BioRender.com. (B) Representative microscopy data of SMO protein immunostaining non–FUS-treated group (left) and FUS-treated group (right) demonstrating substantial SMO protein knockdown. SMO protein is shown in brown, and nucleus staining is shown in purple. (C) Quantification of SMO protein level in medulloblastoma tumor (fivefold, P = 0.0483). (D) Representative fluorescent microscopy data of SMO-siRNA–induced cell apoptosis in tumor at 30 hours after LPH:SMO-siRNA administration for non–FUS-treated group (top) and FUS-treated group (bottom) using TUNEL assay. (E) Quantification of tumor cell apoptosis (TUNEL-positive signal) that is LPH positive with and without FUS at 30 hours after treatment (16.6-fold, P = 0.0013). (F) Representative fluorescent microscopy data of SMO-siRNA–induced cell apoptosis in tumor at 30 hours after LPH:SMO-siRNA administration for non–FUS-treated group (top) and FUS-treated group (bottom) using CC3 assay. (G) Quantification of tumor cell apoptosis (CC3-positive signal) that is LPH positive 8 hours after nontherapeutic LPH:Cy5-siRNA delivery administration (n.s.) and 30 hours after LPH:SMO-siRNA delivery administration with and without FUS (34-fold, P = 0.0017). Plots show means ± SEM (N = 3). P values were determined by unpaired t tests. n.s., P > 0.05; *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01.

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图5. MB-FUS,与阳离子LPH结合:smo.-SiRNA,诱导细胞凋亡的Medulloblastoma的Shh活化亚组细胞凋亡。

一种)LPH的示意图:siRNA诱导的细胞凋亡。模拟图是创建的biorender.com。(B.)代表性的显微镜数据smo.蛋白免疫染色非fus处理组(左)和fus处理组(右)显示实质smo.蛋白质击倒。smo.蛋白质为棕色,细胞核为紫色。(C)量化smo.成神经管细胞瘤肿瘤的蛋白水平(5倍,P.= 0.0483)。(D.)代表性的荧光显微镜数据smo.LPH 30小时后- sirna诱导肿瘤细胞凋亡:smo.- 使用TUNEL测定的非Fus治疗组(顶部)和FUS处理基团(底部)的-siRNA施用。(E.)肿瘤细胞凋亡(tunel阳性信号):治疗后30小时LPH阳性(16.6倍,P.= 0.0013)。(F)代表性的荧光显微镜数据smo.LPH 30小时后- sirna诱导肿瘤细胞凋亡:smo.- 使用CC3测定的非Fus治疗组(顶部)和Fus治疗组(底部)的-SiRNA给药。(G)肿瘤细胞凋亡(CC3阳性信号)的定量是无菌液体溶解后8小时的LPH阳性:CY5-siRNA递送给药(N.S.)和LPH后30小时:smo.-siRNA给药与不给药(34倍,P.= 0.0017)。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。P.由未配对确定的值T.测试。N.S.,P.> 0.05;*P.≤0.05;**P.≤0.01。

四十纳米阳离子纳米颗粒联合MB-FU,在脑TME中的颅骨,间质和型牙细胞转运之间获得精细平衡

We postulated that quantitative image analysis and physiologically based pharmacokinetic (PBPK) modeling could be used to extrapolate findings to refine the design of the LPH and better understand its transport dynamics in the TME when combined with MB-FUS (e.g., BBB permeability, interstitial transport, and cell uptake), which would otherwise require extensive biological experiments. We used a well-established PBPK model that captured the diffusive and convective transport of nanoparticles from the blood vessel, across the BBB, in the interstitial space, and into the cells (37.50.)。为了减少外推误差,我们利用基于实验特定目标函数(图6A)。模型输出和参考解决方案之间的实质重叠(图6A)表明模型与实验数据(GL261胶质瘤肿瘤的rhoB-LPH之间的收敛性,并且可能降低的外推误差。所识别的模型参数显示血管有效扩散系数之间的显着差异,D.V.(20倍增加,P.= 0.04),和间质液压导电性,K.一世(增加40倍,P.= 0.006),对于FUS组和非FUS组(图6B.)。这些数据证实了我们之前使用小型抗癌药物(23.),提供一个定量评估MB-FUS促进GL261胶质瘤TME中LPH转运动力学的急性变化而不产生任何重大副作用的能力。

Fig. 6 Integrated quantitative microscopy and PBPK modeling guides the integration of LPH nanoparticles and MB-FUS technologies.

(A) Parameter identification procedures to recover LPH pharmacokinetics from the experimentally determined RhoB-LPH penetration (line profile perpendicular to vessel wall, left) in the GL261 glioma tumor model using 2D tumor cord geometry. The model output and the reference solutions agreed (right). (B) Normalized parameter fit for non–FUS-treated and FUS-treated groups using 2D tumor cord PBPK model. (C) Structurally heterogeneous modeling of LPH transport in TME. (D) Sensitivity analysis of the model parameters. (E) Cellular uptake of LPH with different sizes for non-FUS and FUS. (F) Transvascular flux with different surface charge LPH for non-FUS and FUS. Difference between different LPH sizes for non-FUS and FUS (one-way ANOVA). *Difference between non-FUS and FUS for each LPH size or surface charge (unpaired t tests). Extracellular LPH concentration (Ce) and intracellular LPH concentration (Ci) normalized to maximum LPH concentration inside the vessel (Cv). Dv, vessel diffusion coefficient; Di, interstitium diffusion coefficient; Kv, vessel hydraulic conductivity; Ki, interstitium hydraulic conductivity; V, rate of endocytosis. The plots show means ± SEM (N = 3). In (B) and (C), the P values were determined by unpaired t tests. *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001, ****P ≤ 0.0001, ††P ≤ 0.01, †††P ≤ 0.001, ††††P ≤ 0.0001.

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图6. 综合定量显微镜和PBPK模型指导LPH纳米粒子和MB-FUS技术的集成。

一种)使用2D肿瘤脐带几何形状,从实验确定的rPH-LPH-LPH渗透(垂直于血管壁,左侧的线轮廓)中回收LPH药代动力学的参数鉴定程序。模型输出和参考解决方案同意(右)。(B.)采用二维肿瘤脊髓PBPK模型对非fus治疗组和fus治疗组进行归一化参数拟合。(CTME中LPH传输的结构性异质建模。(D.)模型参数的敏感性分析。(E.)对于非Fus和Fus的不同尺寸的液体摄取液晶溶液。(F不同表面电荷LPH对非FUS和FUS的经血管流量的影响。非Fus和FUS(单向ANOVA)不同LPH尺寸之间的差异。*每个LPH尺寸或表面电荷的非Fus和Fus之间的差异(未配对T.测试)。细胞外溶解液浓度(CE.)和细胞内LPH浓度(C一世)归一化为容器内的最大LPH浓度(CV.)。D.V.,血管扩散系数;D.一世,间隙漫射系数;K.V.,血管液压导率;K.一世,间质水力传导率;V.,内吞作用率。绘图显示平均值±SEM(NG.ydF4y2Ba= 3)。在(b)和(c)中,P.由未配对确定的值T.测试。*P.≤0.05,**P.≤0.01,***P.≤0.001,****P.≤0.0001,††P.≤0.01,†††P.≤0.001,††††P.≤0.0001。

为了评估定义TME中转运动力学的参数的相对重要性,并确定最大核酸传递到癌细胞的最佳LPH物理性质,我们进行了参数敏感性分析。具体来说,我们局部调整(一次一个)已确定的建模参数(±25%),随后记录注射后1小时(LPH清除时间)对肿瘤LPH摄取的影响。为了考虑肿瘤血管的异质性对间质药物转运的影响,我们扩展了肿瘤脊髓的几何形状(即肿瘤包围的圆柱形血管;图6A)血管网络几何(图6C.)。经过进一步的改进,模型显示MB-FUS组与非fus组相比,LPH经血管运输、外渗和穿透明显增加(图6C.)。这与实验观察一致(图。23.)。仅限LPH-ONLE的组确认BBB / BTB是脑肿瘤中纳米医生递送中最重要的速率限制因素(即,最高标准化值图6D.)。Fus-LPH组显示MB-FU明显降低了BBB渗透率的相对重要性(参数描述D.V.图6D.)和间隙流(由参数描述K.一世图6D.),对脑TME中观察到的改善洛克洛克的改进传递提供机械理解。它还表明内吞作用的速率(由参数描述V.图6D.)成为MB-FU后LPH递送的速率限制因子,可能是由于脑TME中较高的LPH可用性。

值得注意的是,评价纳米粒子尺寸对运输动力学的影响表明,在MB-FU下,与10-或80nm颗粒相比,40nm颗粒可能导致更高的摄取量(图6E.)。在不破坏脑肿瘤中递送核酸治疗剂的最佳纳米颗粒尺寸约为20nm,这与BBB施加的其运输的物理障碍一致(10.),而MB-FUS最佳尺寸约为40nm。这些数据还强调对流转运的相对重要性,这对于较大的纳米颗粒至关重要,并且通过MB-Fus显着改善。同样,与带负电荷的颗粒相比,正电荷颗粒导致流体磁通量的显着增加(图6F.)。一世n summary, the proposed quantitative framework that is based on single-cell image analysis and mathematical modeling allowed us to quantify the FUS-mediated changes in the LPH transport dynamics in the TME and establish design rules (i.e., LPH size and charge) for robust siRNA delivery in brain tumors with MB-FUS.

讨论

本调查的目标是确定克服脑TME中有效递送siRNA治疗剂的运输障碍的策略。虽然病毒和非血管基因载体都可以用作核酸的递送载体,但病毒载体受到毒性,免疫原性,低负载能力和高生产成本的限制(51.)。因此,在本研究中,我们专注于siRNA纳米粒子制剂。正如我们所阐明的那样,我们研究的关键方面之一是使用荧光显微镜(Cy5-siRNA)和鱼(Cy5-siRNA)和鱼(smo.核)。后者允许我们直接显示,免疫活性的动物,MB-FUS siRNA交付可以减少致癌基因驱动肿瘤并导致显著增加癌症细胞死亡,从而建立一个因果关系在BBB / BTB渗透率的变化,纳米颗粒/核渗透和吸收,和肿瘤细胞死亡。与之前的研究相比,这是一个重大进展。之前的研究提供了宏观证据,表明使用负载在阴离子纳米颗粒上的荧光素酶质粒DNA成功转染大脑TME (32.)。此外,所证明的高液体:SiRNA被癌细胞吸收到两种单独的恶性胶质瘤和Medulloblastoms的临床前模型,与BBB和BTB的高渗透相结合,强调了靶向肿瘤核心和渗透的提出的治疗策略的潜力保证金,目前仍无法治疗无法进入(15.)。

此外,我们的结合实验和建模研究表明,平衡MB-FUS获得的改进的分发性和间质运输与高渗透率和癌细胞摄取的40nm弱阳离子纳米颗粒是至关重要的,对于脑TME的鲁棒递送和摄取至关重要。这些发现,从基于50-100nm多分散的阴离子纳米颗粒(<-5mV)的电流方法进行显着脱离,在脑肿瘤中提供了药物递送的范式转变,其中物理方法和纳米技术一起调整系统地鉴定最佳的FUS药物组合,并制定有效递送脑肿瘤中核酸的合理策略。虽然使用不同尺寸和表面电荷的纳米颗粒的额外实验数据将进一步巩固观察到的趋势,我们的研究结果(图5.)与使用较大的纳米颗粒(50至100nm)相比,在过去的纳米颗粒(50至100nm)相比,在过去的纳米颗粒(50至100nm)相比,在使用较大的纳米颗粒(50-100nm)的情况下,提供了较低的药物递送的可言论解释,与非-Fus;表S1)。通过表面官能化可能会改善这些发现,包括细胞特异性。增加每个实验组的样本量(表S2)将允许进一​​步评估我们的发现的再现性,并更好地评估肿瘤异质性如何影响所提出的治疗策略。虽然过去具有类似剂量的脂质纳米粒子的生物分布和毒性调查,但我们在本研究中使用的类似剂量报告毒性可忽略不计(41.-43.),在不同洛克(不同LPH下的患者衍生的肿瘤中评估治疗结果(肿瘤生长和生存期)在患者衍生的肿瘤中评估治疗结果(肿瘤生长和生存),并在不同的LPH下进行扩展的毒理学分析:SiRNA剂量。测试额外的Fus暴露(例如,较低的谐波发射),理想地在闭环控制下(52.-55.),结合对BBB表型(即结构和功能)和脑/肿瘤组织的更详细评估(56.57.)将进一步定义和完善MB-FUS治疗窗口,使siRNA在脑TME中安全有效的传递。

我们的研究结果展示了我们工作的潜力,导致在脑肿瘤中有效递送核酸的合理策略,并为脑TME中的siRNA递送的前瞻性,定量和机械研究提供统一的框架。这里建立的原理也可以扩展到目标信号通路的多个部分,使其敲低影响生存/增长(58.59.),克服耐药性问题(60.),并为提供shRNA,反义RNA或CRISPR-CAS9创造独特的机会(261.)和增强免疫疗法。

材料和方法

LPH:siRNA制造和表征

使用略微改性的旋转的微径反应器制备阳离子溶解液(直径40nm)(38.)。简而言之,含有聚(D.L.-乳酸-co-乙醇酸(PLGA) (0.3 mg/ml)在乙腈和另一种含1,2-二棕榈酰-- 甘油-3-磷光籽(DPPC)(0.018mg / ml),1,2-Dipalmitoyl-- 甘油-3-磷酸乙醇胺 -NG.ydF4y2Ba- (Lissamine Rhodamine B磺酰基)(0.015 mg / ml)(Liss Rhod Pe),NG.ydF4y2Ba1- [2 - ((1S.)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基羧基)乙基]-3,4-二[油氧]-苯甲酰胺(MVL-5) (0.02 mg/ml), 1,2-二硬脂酰-- 甘油-3-磷酸乙醇胺 -NG.ydF4y2Ba- 将4%乙醇中的[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)(0.02mg / ml)引入旋转的微伏反应器,在雷诺数250中。调整所有这些参数以产生40-nm-大小的粒子。过滤制备的颗粒并以2900rpm离心15分钟三次以除去任何杂质。

用于将siRNA加载到LPH上的技术类似,尽管使用的前体与siRNA是带电分子的前体不同。使用的聚合物核是PLGA,而使用的脂质前体是DPPC,Liss Rhod Pe,DSPE-PEG和MVL5。在剧烈涡旋下以5:1(w / w)的比例将阳离子溶解与siRNA混合,这使得最佳siRNA加载到LPH上。本研究中使用的两种不同的siRNA是从地平线发现(Dharmacon,Lafayette,Co):Cy5-siRNA(Sistable Nontargeting;目录号:D-001700-01)和SmartPool(四个siRNA的混合物;目录号:L-041026-00-0020)On-TargetPlussmo.- 标准siRNA。在补充材料中提供siRNA序列。

用硫化剂纳米(Malvern仪器,Malvern,UK)获得阳离子LPH和LPH的流体动力学体积和表面电荷:siRNA。样品的形态由120 kV的透射电子显微镜(Hitachi 7700,Hitachi,日本)取出与来自Gatan的数字显微照片和软件套件相结合。将样品用2%乙酸铀酸溶液呈负染色30秒。

GL261细胞培养

GL261-Luc2胶质瘤细胞(卡尺生命科学)在Dulbecco的改性鹰培养基中培养,其补充有10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素,在37℃和5%CO2

纳米粒子细胞摄取动力学的定量GL261胶质瘤细胞

在24小时内,在玻璃底盘中以20,000个细胞/ ml的密度接种GL261细胞,导致汇合60%。此时,将细胞与阳离子LPH孵育:浓度为0.02mg / ml浓度的Cy5-siRNA,并且在五种不同的时间点(2,4,6,8和10小时,测量纳米颗粒的细胞内荧光信号)使用荧光显微镜。在每个时间点结束时,通过根据制造商的指示使用细胞活力套件计算全部与死细胞来确定细胞活力(ReadyProbes Cell活力成像试剂盒,蓝色/绿色,Thermo Fisher Scientific,目录号R37609)。R37609)。使用imagej测定不同时间点的LPH和Cy5-siRNA的荧光强度的定量。

GL261胶质瘤细胞接种

所有动物治疗都是根据《实验室动物人道护理和使用公共卫生政策》的指导方针进行的,并得到了乔治亚理工学院动物护理和使用机构委员会的批准。GL261细胞(105.遗传修饰以表达萤火虫荧光素酶的细胞,立刻植入在1mm前的1mm前的脑中,1mm左右6〜8周的雌性C57BL / 6J小鼠(杰克逊实验室)(15只小鼠)。在细胞植入后,使用T2加权MRI(药物SASCAN 7T,BRUKER)监测肿瘤生长,当肿瘤达到〜20至40mm时3.,使用定制的MRgFUS执行BBB中断。为了减少不同实验组血脑屏障通透性(基线)的差异(与肿瘤大小的差异有关),在每次实验前,使用MRI测量肿瘤,并在对照组和fus治疗组之间平均分布。

Medulloblastoma肿瘤模型

我们使用了人Shh型Medulloblastoma(千克实验室008831)的SMOA1转基因小鼠模型。通过用Math1驱动的GFP报道小鼠交叉Smoa1小鼠产生Smoa1-Math1-GFP小鼠。小鼠在埃默里大学动物设施中维护,经美国实验室护理的认可协会批准。当小鼠达到10至12周龄时,我们通过MRI确认肿瘤的生长并在研究中注册小鼠。

MRGFUS系统和对GL261肿瘤的超声处理

MRgFUS系统由一个空气支撑的球形弯曲传感器(频率:0.5 MHz, f值:0.70,焦距:25 mm)组成,该传感器连接在一个充满水的三维打印锥上,锥上有一个由聚酯薄膜制成的出口窗口。该系统在一个手动3D定位系统上安装了一个表面线圈,在MRI的引导下,可以以毫米级的定位精度对不同的大脑目标进行声波定位。在超声实验中,使用以下暴露设置:10 ms脉冲,每1 s持续1分钟,同时静脉注射临床级mb (100 μl/kg;Optison)。在本研究中使用了475 kpa的峰值负压(基于自由场测量-水)。为了覆盖整个肿瘤及其周围,我们进行了四次不重叠的超声检查(X-y方向)。在声音之前,使用整个大脑的T2加权MRI鉴定肿瘤位置。在超声处理之后,将动物注射钆造影剂(饲料,0.4ml / kg)和T1加权对比增强的MRIS,以确认在肿瘤和周围健康组织中的BBB中断。确认BBB破坏后,静脉内施用纳米颗粒,并在10分钟(用于LPH)或8小时(LPH:siRNA)纳米颗粒注射时将动物安乐死。最后,收获大脑进行进一步处理。

USGFUS系统和Medulloblastoma肿瘤的超声

为了在Medulloblastoma肿瘤中进行BBB中断,我们使用了一种定制的便携式USGFUS系统,通过被动空化检测(PCD)具有高目标精度和MB动态的实时监测。首先,USGFUS系统通过栅格扫描安装在3D定位系统上的单元素成像传感器(3.5 MHz)的单元素成像传感器(3.5MHz)创建2D轮廓。然后使用该图像来估计眼睛的位置,然后与MRI图像进行比较以定位肿瘤。然后,系统允许在四个非手术区域执行超声处理,以覆盖整个肿瘤与同轴治疗FUS换能器(0.5MHz)。在超声处理期间,将成像换能器切换到被动模式以捕获MB的响应,然后将其频谱标准化为在MB到达之前记录的频谱的平均值,以消除除MB响应之外的不必要的排放(图S4)。通过从每个谐波频率-3中取出±5频率箱的平均值获得谐波,超声和宽带水平F0.,2.5F0.和6.72F0., 分别。在BBB中断期间PCD允许我们捕获谐波排放的发作,并确保安全有效的中断。

大脑组织处理

在纳米粒子施用后10分钟安乐死的动物组中,收获大脑而不进行转丝灌注。在8小时(胶质瘤肿瘤瘤小鼠)和30小时(Medulloblastoma肿瘤瘤小鼠)和30小时(Medulloblastoma肿瘤瘤小鼠)在收获脑袋之前与20mL盐水转向括起来。用4%多聚甲醛在4℃下用4%的多聚甲醛过夜固定,然后30%蔗糖溶液(4℃),直至其沉入容器的底部。将脑置于O.C.T.(最佳切削温度)化合物,快速冷冻至-80℃。随后,使用低温恒温器(Leica 3050 s Cryostat)切割30μm部分。

免疫荧光染色和显微镜

首先通过在室温下在4%多聚甲醛中固定10分钟来染色组织。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后,首先将该部分在室温(2%牛血清白蛋白和PBS中的5%山羊血清中)封闭1小时,然后与在1%牛血清白蛋白中稀释的一抗孵育(1:100)在4°C下12小时。兔抗小鼠CD31(AB28364,ABCAM Inc.)用于容器染色,并且兔抗萤火虫荧光素酶(AB21176,ABCAM Inc.)用于GL261细胞的染色。接下来,将该部分与在室温下在1%牛血清白蛋白(1:250; A31556,Invitrogen)中稀释1小时的山羊抗兔Alexa Fluor 488二次抗体。为了染色细胞核,在洗涤后,将样品与在PBS(1:1000; 62248,Invitrogen)中稀释的DAPI一起温育。最后,用PBS冲洗这些部分以除去多余的抗体,安装有安装介质(延长玻璃避压器,批次NO。2018752,Invitrogen),并用盖玻片覆盖。在成像前,用安装介质在黑暗中用安装介质固化样品。同时,还进行H&E染色以确认肿瘤的位置(图S2)。

切片用20×物镜成像,激光扫描共聚焦显微镜系统(LSM 700, Zeiss)。用于细胞核、血管/癌细胞、阳离子LPH和siRNA的激发波长分别为405、488、555和639 nm。利用ImageJ对荧光图像进行定量。利用定制的MATLAB代码,利用垂直于血管的2 μm薄层对荧光信号进行积分,从而量化LPH和siRNA的穿透。

鱼化验

使用Cy5荧光团的四种DNA寡核苷酸探针检测smo.-sirna。使用具有Cy3荧光团的DNA寡核苷酸探针检测Nontargeting siRNA。将探针溶解在pH8.0的Tris-EDTA(TE)缓冲液中以制备100μM储备溶液。

将固定的组织样品在-20℃下在70%乙醇中透透化24小时。在渗透后,首先使用尼康Ti2显微镜用20×物镜扫描样品,并且用60×物镜扫描小区域。然后用2×SSC洗涤样品,然后在室温下在洗涤缓冲液(30%甲酰胺)中孵育5分钟。洗过洗涤缓冲液后,将样品在1ml杂交溶液中孵育(杂交缓冲液:30%甲酰胺和10%葡聚糖硫酸盐;杂交缓冲液中的稀释探针溶液制备杂交溶液;每次探针1μlsmo.-SiRNA和2μL用于非靶向siRNA的探针库存,在室温下在加湿室中24小时。然后,将样品在洗涤缓冲液中温育5分钟。为了染色核,将样品在2×SSC(1:500)中的DAPI稀释中孵育5分钟。然后用2×SSC洗涤样品三次以除去多余的探针。最后,将样品安装在安装缓冲液中(Tris-HCl,8%葡萄糖,1:100催化剂酶,纤维以7:1:1:1的比例混合,并使用尼康Ti2显微镜进行成像。DAPI,GFP阳性细胞,LPH和鱼探针的激发波长smo.-siRNA的波长分别为395、470、555和640 nm。非靶向siRNA探针的激发波长为555 nm。更详细的信息在补充资料中提供。

细胞凋亡检测

为了获取离体细胞死亡,我们使用冷冻脑组织,然后按照制造商提供的协议对细胞死亡标记CC3(9661,细胞信号技术)和TUNEL分析(C10619, Invitrogen)进行染色。CC3-和tunel阳性细胞的部分在肿瘤中也是LPH阳性(归一化到DAPI染色),使用定制的MATLAB代码进行量化。

免疫组织化学染色

首先通过在室温下在室温下在4%多聚甲醛中固定10分钟并用PBS洗涤来制备组织。中和内源过氧化物酶3%h2O.210分钟后,切片用蛋白阻断缓冲液孵育10分钟,然后用一抗孵育。反smo.(E-5:SC-166685,Santa Cruz Biotechnology Inc.,Dallas,TX)染色是使用DAB(3,3'-二氨基苯甲酸)(传染媒介实验室,Burlingame,Ca)开发的,然后由苏木精定向阳致(Milliporeigma,St.Louis)开发,mo)。还进行了H&E染色以进入肿瘤的位置(图S6)。这smo.使用Imagej定量脑肿瘤内部的蛋白质强度。

脑TME中纳米粒子输送的数学建模

为了量化Fus治疗前后的运输参数,我们使用2D肿瘤帘线几何形状使用PBPK模型(图6A)。该模型包括腔面积,血管壁和间隙空间,如前所述(23.)。简单地说,该模型充分耦合了纳米颗粒通过血液和穿过内皮进入间质空间的扩散和对流运输以及被肿瘤细胞摄取。用Stokes方程将血管内的血液模拟为层流。用Brinkman方程模拟了流体通过血管壁和空隙的流动,这些空隙被认为是多孔介质。纳米颗粒的输运在腔内是对流扩散问题,在间隙内是反应对流扩散问题。我们将任何药物的细胞外浓度定义为相对于血管内血流中的峰值浓度的连续标量场。血液和组织液假定是均匀的、牛顿的、不可压缩的等粘度流体。

实验测量的LPH浓度用作腔入口处的边界浓度(图2D),并将带有诺伊曼边界条件的出流应用于计算域的其余边界。数学模型的参数,包括血管和间隙扩散系数(D.V.D.一世),血管和间质液压导电性(K.V.K.一世)和细胞跨膜运输(V.),使用基于从文献(表S3)和实验特定的目标函数所取的初始参考值的数值优化过程。

由于实验测量的LPH药代动力学的不可用,我们设计了一种基于实验确定的LPH渗透数据来回收间质中的洛克药代动力学的程序(图6A)。在每个实验中,我们根据GL261胶质瘤模型中LPH递送的实验数据(图6A)。每个实验的目标函数是根据LPH在肿瘤内随机选择的三个位置的穿透平均值来生成的。我们假设动力学是由一维对流扩散问题的解析解控制的,只有一个输运参数,D.,这描述了如下的LPH运输的总体速率: C X T. = C 0. 1 - ERF. X 4. DT. , 在哪里C0.是血液中的实验测量的溶乳浓度。D.在给药10分钟后,在离血管15 μm处测定LPH浓度(图6A)。总体而言,六种模型被装配,包括每类实验三次重复:非FUS与FUS。

为了研究脑TME的空间结构异质性对间质药物转运的影响,我们使用了一种合成的肿瘤样血管网络几何形状。简单地说,在假定没有渗透压差(50.),虽然间隙内空间内的流动是与达西法的建模。腔亚域内的抗癌剂运输被建模为间隙亚域内的对流扩散问题和反应 - 对流扩散问题,如2D肿瘤帘线模型所述。为研究尺寸和表面电荷对溶液癌细胞摄取和流动通量的影响,我们将障碍调整到血管壁上(补充材料)的扩散和对流运输。最后,我们根据文献的实验数据纳入内吞作用的大小依赖性率(62.-64.)。

使用该模型和上述程序确定的参数,我们进行了敏感性分析,以确定在含FUS和不含FUS的情况下(每组3个)纳米颗粒运输和细胞摄取的速率限制因素。这是通过数值逼近细胞内药剂浓度的导数来实现的C关于任何传输参数P.j,也就是说, C P. j 。为了能够将敏感性与不同参数进行比较,我们使用以下规范化的灵敏度测量 S. = σ. j 最大限度 C C P. j ,其中σ.j是sd的P.j在每个实验课程和最大的四次重复遍历(C)为所测细胞内浓度的峰值。S.应该解释为相对变化中C对于给定的变化P.j所有j都同样可能为了研究粒度和表面电荷对细胞内摄取和流体通量的影响,我们改变了阻碍因子。对PBPK模型的更严格描述和所用方法提供在补充材料中。所有模拟都是使用商业有限元软件,COMSOL(版本5.3A,Burlington,MA,USA)进行,其中使用数学模块添加必要的方程。

统计分析

结果用平均值±SEM表示。所有统计分析均采用GraphPad Prism进行。P.<0.05被认为是统计学意义。

补充材料

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

这是一篇开放获取的文章根据知识共享署名-非商业性许可,这允许在任何媒体中使用,分发和再现,只要由此产生的使用不是为商业利益,并提供原稿被适当引用。

参考和笔记

致谢:我们感谢乔治亚州理工学院帕克H. Petit Institute的光学显微镜核心和组织学核心,用于仪器支持和A. Asber和A. Shaw进行技术援助。我们还感谢J. Seisen在佐治亚理工学院的磁共振成像(MRI)核心设施,用于MRI引导的FUS研究期间的技术支持。资金:该研究得到了Cure基础和NIH补助R00EB016971(NIBIB)和R37CA239039(NCI)的支持。对S.S.的研究支持来自Harold C. Schott赋予了捐赠的椅子和帕姆和汤姆·米尔切尔基金会。作者捐款:Y.G.,D.P.K.,S.,T.J.M.和C.A.设计研究;Y.G.,H.L.,A.V.,J.L.,M.B.T.和C.A.进行研究;J.K.,A.F.C.,R.G.A.和Y.K.贡献了新的试剂/分析工具;Y.G.,H.L.和Z.F.分析数据;y.g.和c.a. wrote the paper; and D.P.K., S.S., T.J.M., and C.A. provided insightful comments in the overall project and edited the manuscript.利益争夺:提交人声明他们没有竞争利益。数据和材料可用性:评价论文结论所需的所有数据均在论文和/或补充资料中。可能要求作者提供与本文相关的其他数据。

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