研究文章 微生物学

多种碳掺入策略在冷海底地壳流体中支持微生物生存

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十搏欧洲杯直播官网2021年4月28日:
卷。7,不。18,EABG0153.
DOI: 10.1126 / sciadv.abg0153

摘要

在渗透海洋地壳的流体中发生的生物地球化学过程对海洋碳循环做出了可测量的贡献,但缺乏对这个巨大的地下碳库的微生物影响的定量评估。我们提供了来自中大西洋洋脊西侧寒冷的含氧基底流体中碳和氮基质产生的微生物生物量的体积和单细胞估算。碳和氮掺入率的广泛范围表明,微生物群落在动态条件下保持良好状态,潜在的碳和氮同化速率从地下沉积物到轴向热液喷口环境。碳酸氢盐掺入率最高的地方是流体与海底海水最隔绝的地方,这表明无机碳的合成代谢可能是补充全球分布的海底地壳环境中普遍存在的古老而难降解的溶解有机碳的一种潜在策略。

介绍

在深海中,海水被带进岩石地壳,经过非生物和微生物的化学变化,然后以热液流体的形式从海底排出,其全球通量可与河流输入相媲美(12)。超过90%的水热流体放电是在中海脊的侧面上循环的低温液(5°至20°C)(1),这些流体通常无法进入,并且它们的微生物组装在很大程度上是未探斗的(3.)。这种凉爽,脊椎微生物组的生物地球化学影响在净化学助熔剂上,特别是深海溶解有机碳(DOC)的巨大,气候敏感储层,可能是大量的,但受到严重受损。本研究,原始,凉爽,玄武岩外部液体(4.)从位于中大西洋洋脊西侧22°N的北池塘的海洋钻孔观测中发现了800万年前的地壳。在这里,含氧地壳流体与海底海水基本无法区分,而且氨、甲烷、硫化氢和铁(II)的浓度低于探测值,表明这些海底地壳流体整体氧化还原能势较低(5.)。而来自深海的DOC被认为是不反应的,对微生物的降解具有抵抗力(6.7.),之前来自这些流体的同位素数据表明,确实存在通过微生物氧化选择性去除DOC的情况(8.9.)和DOC可能是最丰富的还原性基质,可供微生物在冷却的地壳流体中氧化(9.)。

几十年来,通过科学的钻探项目(10.)缓慢的生长缓慢,往往低生物量对于在环境相关条件下证明微生物活性的挑战存在挑战。通过吸收标记的基材的微生物活性已经成功地观察到沉积(11.-13.)和漫射流水热通气流体(14.-16)使用稳定的同位素探测(SIP)孵育与纳米级二次离子质谱(纳米粒子)的单细胞测量孵育,为这些栖息地的初级生产和有机萎缩的潜在微生物贡献提供约束。但是,在地壳生物群系中没有存在这样的数据。在这里,我们确定从脊侧面地壳栖息地的微细胞和散装掺入的单细胞和散装掺入,所述脊椎地壳栖息地代表了地下和上覆海洋之间的大部分流体通量。我们广泛的定量评估突出了微生物种群,以纳入新来源的不稳定有机碳和一致的流体和条件的一致性含量的含量。我们还报告了大量的碳酸氢盐融合,尽管可以缺乏可以燃料的氧化还原能源的无机无机来源,并表明这可能是补充合成代谢碳需求的代谢态碳的一部分,以减少对老化和顽固性的依赖性海洋医生。

North Pond安装了两个软木(Circulation obiation Retrofit Kit)海底钻孔观测台,安装于2011年,地点为综合海洋钻井计划(IODP)站点U1382A和U1383C (图。1A)。U1382A油田的软木从岩石海底沉积物以下的一个深度层段进入循环流体,[海底90至210米(mbsf)], U1383C软木进入三个深度范围:浅层(70至146 mbsf)、中层(146至200 mbsf)和深层(200至332 mbsf)。虽然从两个科克天文台回收的流体地球化学特征与上覆海水非常相似,但放射性碳测量以及溶解氧和DOC浓度的较大差异表明,从U1383C回收的流体比U1382A (5.8.9.)。最近的数值模拟表明,通过岩石地壳存在对流和振动流体运动(17.)而不是沿南北轴线的简单线性流动,如北池的早期研究(4.)。

图1 北池塘位于年轻,凉爽的地壳(8 ma),一个“沉积物池塘”大约13公里,宽7公里,深度为200米。

一种)不同采样位置(U1382A,底部海水和U1383C)和水深(米)以下(m)或海床以下(mbsf)的North Pond软木天文台图。U1383C位于U1382A东北方向约6公里处。散装13.碳-碳同位素掺入率根据(B.13.C-醋酸,(C13.C-bicarbonate, (D.13.每种液体样品的c -甲胺SIP孵育周期依次为12小时、2天和6天(见A)。星号表示通过SIP- nanosims单细胞测量(表3)而不是批量元素分析。没有条形图表示数据低于检测(请参阅材料和方法)。

结果与讨论

本研究中所描述的流体是通过流动泵送系统(MPS) (18.),作为北池塘第三次取样考察的一部分。底部海水也由尼斯金瓶在传导性、温度、深度(CTD)水样采样玫瑰花结上采集。16S.对所有样品(North Pond地壳流体和底层海水)进行核糖体RNA (rRNA)基因测序,结果表明2017年地壳流体中的微生物群落与底层海水中的微生物群落有所不同(图)。S1及S2),一如往年(8.19.)。在地壳流体中,U1382A层的微生物群落更接近底层水,而U1383C层的微生物群落更接近底层水,这也与地球化学数据相一致(5.)。此外,在单独的研究中,在软木塞中孵育的各种矿物芯片进行4至6年(在2017年检索)中,作者在所有样品类型(软木液,底水和矿物芯片)上恢复了类似的分类量并确定孵育流体解释了更多的微生物群落组合物的定植矿物质而不是矿物表面的类型(20.)。这些结果表明,2017年收集的流体,并用于目前的研究,捕获北池塘地壳流体中的主要微生物群落。

2017年软木液的细胞计数范围为2.1 × 103.到5.1×103.细胞ml.-1表1)。2017年的计数低于以前收集的液体的历史细胞计数数据,从高103.低104.细胞ml.-1液体(8.19.)。在其他软木塞中也观察到钻井后的细胞浓度降低[Juan de Fuca脊侧;(21.)和地下水井系统(22.)。连同地球化学资料[表1;(5.)],低电池计数可能表明北池系统已从钻井中恢复,并且2017流体(和导致数据)是迄今为止寒冷的氧气外部面板含水层中微生物活性的最佳表示。

表1 为本研究收集的2017年样品,用于细胞计数、溶解无机碳(DIC)和溶解有机碳(DOC)的North Pond CORK流体和底层水值。

其他地球化学(氧、硝酸盐和pH值)复制自(5.)在2017年也收集。铵浓度从2017年的检测(<0.1μmol/ kg)均为低于检测(<0.1μmol/ kg)(5.)。

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介入底部海水和地壳液都被氘代修改(2H2O)水,可作为微生物合成活性的一般示踪剂(23.)。选择组合13.碳(碳酸氢盐,醋酸盐,甲胺,硅藻裂解液)和15.氮(铵、甲胺和硅藻裂解液)作为合成代谢活性的底物特异性示踪剂(表2)。没有底物加入CN对照中。对于硅藻裂解物,硅藻在同位素富集的存在下生长13.C-碳酸氢盐和15.然后硝酸盐,然后裂解作为对环境相关的复杂有机物的代理。在北池含水层(4°至20°C)中的预期范围内的温度下进行孵育,并从制备三个时间点(12小时,2天和6天)的单独孵育收获细胞;表2)。同位素掺入率是由散装元素分析计算的(图1,B至D)和单细胞纳米粒子测量(无花果。3.)。

表2 北池塘(底水,U1382A,U1383C浅,U1383C中等和U1383C深)稳定同位素稳定孵化稳定同位素探测孵化。

在12小时,2天和6天的每个时间点,在3个不同的瓶子中进行孵育。这里引用的图形中使用的条件标识符,其中C为对照,D为硅藻裂解液,M为甲胺,A为醋酸盐,B为碳酸氢盐或碳酸氢盐,温度以下标表示。

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图2 每个稳定同位素的选定的纳米米比图像(2H,15.n,和13.C)。

一种)最活跃的浅层样品修正与13.C-DIC和15.N-铵(B20.U1383C浅),(B.) U1383C深13.C15.n -硅藻裂解液修饰,其中剩余的硅藻裂解液可见于15.n和13.C的图像,但是2h仅在相关的细丝中看到的吸收(d20.U1383C深),(C13.C15.N-甲胺摄取215.不可见13.c Incorporation(m20.u1383c深),和(D.)最活跃的深层样品(A20.U1383C深)修正13.c-醋酸盐和15.N-ammonium。所有的孵化都用2H2O.秤条,3μm。比例尺度在样本之间不同,以显示每个图像的最大值。

图3 根据U1383C浅层和深层孵育计算的单细胞同位素掺入率。

计算fmol (一种) C及(B.) N细胞-1-1速率基于Nanosims数据,并作为核心密度分布绘制,具有真正的值覆盖。

北塘流体中的微生物种群呈现动态和非均匀条件。有机碳修正培养(醋酸盐和硅藻裂解液)的细胞计数在较早的时间点有最高的细胞密度(图S3)。到2天,所有醋酸盐(1383C中)或硅藻裂解液(所有其他样品)孵育的细胞密度最高。到6天的最后一个时间点,大多数这些有机碳培养的细胞密度低于之前的时间点或CN对照,表明细胞生长的最初阶段是死亡。在地下水井中也观察到这种细胞在最初几天内增加然后减少的模式,没有任何改变(22.),作者将其归因于坏死肿块诱导的细胞生长,这些细胞在孵化初期就死亡了。

在批量分析中13.C-醋酸盐 - ,13.C-甲胺 - ,和13.乙酸碳酸氢盐修正的孵育,乙酸盐掺入在流体和条件下广泛普及(图。1B)。检测到碳酸氢盐掺入不像醋酸盐掺入那样一致,但在某些液体中与醋酸盐掺入相当(例如,U1383C Middle and Deep;图1C.)。与醋酸盐和碳酸氢盐相比,甲胺掺入率总体上较低,但U1383C中在4°和20°C时唯一升高(图。1D)。

除U1383C浅的所有20°C流体外,所有20°C的含量在6天内掺入乙酸盐的大量碳含量最高,其中速率在2和6天之间降低(图。1B)。乙酸盐4℃温育通常低于其20℃对应物(除了U1383C浅,其中12小时在4°C下最高速率;图。1B)。检查碳掺入的单细胞率(图3A)显示U1383C在深部(20°C)和浅层(4°C)各自的原位温度下的速率呈双峰分布。这些数据表明,地壳深部流体中的微生物可能会在顽固的碳源上持续存在,而某些成员则准备好迅速应对更不稳定的有机碳的涌入。

2012年收集的北池塘地壳流体微生物群落的基因组研究恢复了自养CO的基因2固定(8.19.),以及更高程度的融入13.C-bicarbonate比13.C-醋酸(800至4300pmol ml-1-1与不超过104 pmol ml-1-1;表S4)从SIP孵化(8.)。然而,2012年钻井6个月后收集到的流体含有颗粒,地球化学数据表明,它们是地壳流体、底层海水和表层海水的混合物(5.)。13.2017年软木流体的碳酸盐掺入率要低得多,范围从低于检测到94 pmol ml-1-1。2017年底部海水费率(0.95 pmol ml-1-1)与北大西洋深水西部分支的研究相当,覆盖北池位点(0.24 pmol ml-1-114.C-碳酸氢盐,水深2537米;表S4)(24.)。因此,在这些早期研究中,碳酸氢盐的掺入可能是人为增加的。

仍然,在本2017年乙酸乙酯掺入的碳酸氢盐的掺入率令人震惊,因为缺乏通常用于化学萎缩的电子供体。虽然氧气丰富,甲烷,硫化氢,铵和铁还在低于检测限度(5.8.),不太可能助长北塘地壳流体中广泛的自养碳固定。

虽然,通过玄武岩表面上的氧化和硫矿物质的氧化驱动的有限碳固定仍然可以13.对玄武岩样品进行的碳酸盐稳定同位素培养和这些岩石的宏基因组学调查显示,没有确凿的证据表明碳固定(25.26.)。然而,全球估计表明它在地壳演化的前1000万年(Ma)中具有重要意义(27.),而岩石表面生物膜的化学增石作用可能没有被观察到的体积速率。

鉴于我们在孵化中可以与化学脱发的缺乏电子供体,在我们的实验中不太可能发生摇滚驱动的自革脱发。对我们实验中使用的同一2017年北池流体的Metagenomic和MetaTranscriptomic分析表明,在所有取样视野中的自养基因表明有机营养基因的转录,表明使用有机碳的微生物群体(28.)。碳固定转录本在1383C中部和深部最为丰富,其中碳酸氢盐掺入率也最高。此外,来自液体的宏基因组组装基因组(MAGs)显示,许多MAGs包含与硫化物和硫代硫酸盐氧化有关的碳固定途径,但这些MAGs也包含大量胞外蛋白酶和碳水化合物分解代谢基因,这与混合营养的生活方式一致。

这些北池塘的结果符合南太平洋(南太平洋)下方〜33-和104马玄武岩地壳中报告的杂养细菌的主要疗养29.),以及大西洋海底超镁铁质和辉长岩(30.31.),其中有机营养微生物过程也占主导地位。

因为DOC是北塘地壳流体中浓度最高的还原基质(20 ~ 31 μmol/kg DOC;表1),与有机和无机碳的合成代谢相结合的有机萎缩是观察到的碳酸氢盐的吸收更可能的解释。虽然碳酸氢盐的合成代谢掺入是在环境环境中的曝光率,但它已在具有纯文化的实验室条件下证明。例如,假单胞菌am1,旋瘤粗糙的vulgare., 和Methylobacterium extorquens能够使用乙基丙二酰辅酶a途径和丝氨酸循环的组合,导致多达50%的生物质碳从碳酸氢盐(32.33.)。

我们假设有机营养加上有机和无机碳的合成代谢反映了微生物群落优化了岩石海底的低潜在氧化还原能条件。地壳流体DOC很可能代表在流体被带入地壳后,在较短的时间尺度上去除更多的生物可用性成分后所保留的深海DOC的一部分(9.)。我们的结果表明,单独的这种降解的DOC支持活性微生物群,因为即使在不加入碳或氮气或其他还原的底物中也观察到细胞生长。通过有机营养途径和碳酸氢盐可以基本上氧化用于能量的能量,可以提供补充,并且不那么代谢地昂贵的碳源。

从2017年的碳酸氢盐的成长率在U1383C的深液中的时间点始终如一,并且在4°和20°C的2天温育中,用U1383C中间流体中的最高液体图1C.)。U1383C中、深部流体也是最“老化”或“老化”的流体14.c缺失DOC (9.)。与U1382A的底层水或液体相比,U1383C液体中的DOC的放射性碳年龄为7300至9200年,芳香度指数和富羧基脂环分子(CRAM)百分比更高(9.)。因为所有海底深处U1383C的DOC浓度都低于U1382A (表1),组成证据表明,在U1383C时,DOC老化程度和降解程度最高(9.),该站点的微生物群落可以通过加入碳酸氢盐来补充它们的合成代谢需求而获得最大的收益。我们的结果表明,微生物不存在一个浓度限制,低于这个浓度就无法获得天然DOC (34.[相反,还有可能是通过组合从无机和有机碳源的生物量产生(图S8)来访问深海Doc的老化和顽固级数的不同策略(图S8)。这可以补充其他寡营策略,以利用低DOC(<4μm)条件下的各种有机碳来源(35.)。

虽然溶解的氮在北池塘的研究比DOC较少,但通过硝化的铵损失已经在基于地球化学通量(5.)。所有提供的氮源分析来自U1383C深(15.N-铵,15.N-methylamine,15.N-硅藻裂解物)和U1383C浅液(15.基于NanoSIMS分析(图3B.)。人们普遍认为何时15.n -铵与13.配以c -乙酸盐时,氮的掺入率高于配以c -乙酸盐时13.C-碳酸氢盐。还有人观察到这一点13.C-和15.n-硅藻裂解物C和N掺入率类似于15.N-ammonium和13.在20°C U1383C深度孵育12小时时,C-乙酸C和N的含量。因此,当同时提供有机碳时,有机氮的同化速率可能会更高(表3和图S8)。

表3 从NanoSIMS 12小时培养数据中获得的每个细胞和每毫升碳和氮的平均吸收速率。

在每个流体源的现场温度附近进行的孵育用灰色表示。

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在所有流体中观察到甲胺掺入。最高的甲胺掺入率(72pmol C ml-1-1)来自相同条件下的碳酸氢盐掺入率最高,U1383C中20°C,在2天。这表明中间流体对不同碳源的适应程度最高,碳酸氢盐和甲胺碳掺入率最高,乙酸酯掺入率第三高。来自氧浓度与北塘地壳流体相似的缺氧区(ODZs)的其他简单有机氮化合物的碳吸收速率与甲胺的整体碳吸收速率相当(36.),如尿素和氰酸盐(5 ~ 12 pmol C ml-1-1和2至14 pmol c ml-1-1分别;表S4)。而在ODZ条件下,相同化合物的氮掺入速率为2 ~ 265 pmol N ml-1-1,远高于来自North Pond微生物群落单细胞分析的平均氮掺入率(表3),来自硅藻的最高平均速率为6pmol n ml-1-1铵是1pmol ml-1-1。总的来说,这表明C和N都可以从北塘地壳流体的有机氮源中掺入,而且从这些有机氮源中,北塘C掺入率与ODZ掺入率更相似,而不是N掺入率。

凉爽的地壳含水层流体似乎比稳定的地下沉积和扩散流热液喷口更能支持更广泛的微生物活动。平均观察到的单细胞摄取率(10-3到100.fmol C或N细胞-1-1;表3)含有富含碳酸氢盐和铵的富含富含有机型海洋沉积物的Sip-Nanosims率之间的差异(10-2fmol C或N细胞-1-1;表S5)和东太平洋崛起的漫流水热通风液与碳酸氢盐(100.到101fmol C细胞-1-1;表S5)。在20°C的孵育条件下(U1383C Deep with acetate and铵在1 fmol C cell)观察到最高的平均C和N North Pond掺入率-1-1和0.1 fmol n细胞-1-1;U1383C与碳酸氢盐和铵在3 fmol C电池浅-1-10.4 fmol N电池-1-1;表3)。虽然这一范围的上限只能在孵化条件下观察到,但最高的平均速率来自没有提供额外DOC的孵化(碳酸氢盐修正),这说明了利用老化的DOC和很少或没有无机氧化还原活性底物来节约能源,North Pond地壳微生物具有高合成代谢率的潜力。在20°C的浅层流体中观察到的更高的碳酸氢盐吸收也可能是补充碳酸氢盐合成代谢的结果,这使得较冷的原地流体群落在较暖的培养温度下更快地利用生长,类似于使用碳酸氢盐补充可用DOC的深层群落。因此,除了对海洋碳氮循环的影响外,广泛的潜在掺入率可能对理解海底生态系统的进化限制具有额外的重要意义,迄今为止,海底生态系统一直基于沉积和扩散流“端元”海底生物群落。

全球一阶估计近似为1011.到1012.Mol有机碳每年都可能被纳入凉爽的海底地壳含水层流体中。这是根据北池塘时代地壳(<10 Ma)的可居住孔隙体积估算得出的,以及U1383C浅层和深层流体孵育的平均单细胞吸收速率,该孵育过程采用与原位条件最相关的温度(表4)。从有机碳流体生物量产生的平均估计同意估计从10时从酷地壳中取出DOC11.MOL DOC岁月-19.)并表明大多数Doc损失可能与有机营养和合成代谢过程相关联。我们还发现有机氮气可以以10的平均速率在该系统中代谢为1010.到1011.摩尔N年-1

表4 C或N年的估计平均,最大和最小摩尔数-1在年轻(<10 Ma)地壳流体中产生,用于每种流体在接近原位温度的温度下进行孵育。

估计是基于U1383C浅层和深层样品的NanoSIMS分析的单细胞平均、最大和最小碳和氮同位素掺入率。

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估计碳酸氢盐的掺入约为1010.到1011.摩尔C一年-1表4)通过向地壳含水层添加更多不稳定的有机碳的潜在机制(图S8)。来自年轻地壳流体的这一估计高于10次从10中的水热系统估算9.摩尔C一年-124.),表明在全球范围内,冷地壳流体的碳酸盐利用可能与轴上热液喷口流体同等或更重要。

材料和方法

样品采集

2017年10月,在北塘(北纬22°45′和西经46°05′)进行AT39-01巡航时,采集了玄武岩含水层的流体r / v atlantis使用ROV Jason II.在39-01次探险期间。流体从两个软木安装中取样,每个软木安装都有脐带,可在海底和终止于地下水文区:U1382A(包括一个脐带)和U1383C(包括三个脐带:浅,中间,深;图1表1)。过滤后的样品用MPS (8.18.)。通过监测地球化学参数来评估样品纯度。使用内联光电极氧/温度传感器(Aanderaa,卑尔根,挪威)连续监测流体的温度和氧气浓度。在过滤之前,冲洗脐带线,直到氧气浓度稳定并且达到在每个地平线中先前观察到的预期值。然后,通过0.22μm,47毫米GSWP过滤器(Milliporeigma,Ma,Ma,USA)以0.22-μm,47毫米的速度(每分钟/分钟)的速率〜0.5Lpm(每分钟)的速率泵送地壳流体。MPS样品纯度已经在其他软木安装中进行了演示,其中地壳流体的地球化学与海水更有关(21.)。在恢复期间,流体也很小地干扰并保持在取样和孵育之间的窄温度范围内。此外,过滤底部海水并通过将MPS泵入口缩小到海底〜5米,泵送80分钟。海底收集的所有过滤器都有一个RNATATER(AMAMION,AUSTIN,TX,USA)的水库,可以探讨在原位固定中(18.)。回收后,从储存器中除去过滤器并置于新鲜的RNALATER中,在4℃下孵育18小时,随后储存在-80°C船上。

含水层流体也由MPS收集(0.5 LPM ~20分钟)到多个酸洗定制的15升Tedlar袋中,用于船上SIP孵育和船上过滤。大约10升被串联过滤,以捕获“颗粒附着”(5 μm)和“自由生活”(0.22 μm)馏分(47毫米GSWP, MilliporeSigma)。Tedlar袋液体通过蠕动泵、无菌酸洗管和无菌针头(用于培养)转移到SIP微结构中。微型系统的底部海水由尼斯金瓶通过CTD水样莲座收集到与原位MPS过滤器相同的底部海水深度。这些液体是通过将尼斯金瓶带入实验室收集的,并以与MPS袋液体相同的方式进行处理。甲板上的过滤使用与海底相同的原位固定过滤支架进行。

DNA提取,16S.rRNA基因的扩增、测序和分析

使用酚氯仿方案提取DNA(16)和船上所有四个软木层(1382A和U1383C浅、中、深)和底部海水样本(MPS和CTD)的过滤器,以及两种过滤器大小的馏分。16S.使用改性地球微生物组项目底漆制备和测序RRNA基因扩增子文库并测序,并使用改性地球微生物组项目引物(37.-40)。16S.rRNA基因reads用mothur (v.1.39.5;38),利用SILVA v128数据库(41.)。这些OTUs的距离矩阵使用Bray-Curtis dissimilarity与vegan (42.)。然后利用R函数cmdscale对该矩阵进行经典多维尺度排序,并根据最大允许簇数(5)和隶属度指数(1.5)进行聚类。在分类图生成中,只保留大于或等于单个样品0.5%的OTUs,并使用R ggplot工具进行显示(43.)。

SIP孵化

在50ml血清小瓶中制备孵育,用标记的底物在酸洗和燃烧的玻璃器皿中加入具有卷曲的高压灭菌的丁基橡胶塞。所有血清小瓶含有5毫升99.99%2H2O、碳、氮同位素的最终浓度为0.2 mM13.C-碳酸氢钠,1.5μm13.C-醋酸钠(双碳标签),10nm15.氯化铵,4 μM15.N13.c -甲胺HCl,估计为2 μM13.C和4 μM15.来自硅藻裂解物。将样品液(〜45mL)加入每个小瓶中,总体积为50mL。所有同位素来自剑桥同位素(tuwksbury, MA, USA)。还包括NO C和N标签的控制。在流体加入预订瓶后,在室温(〜20℃下,在巡航期间监测,在巡航期间监测,孵育12小时,2天或6天,并保持在±1°C)或4°内。c在步入式冰箱里。我们选择20°C作为上温度限制,因为北池塘的早期温度测量建议在大约600 MBSF的地下置温度高达20°C(44.)。我们选择4°C作为较低的温度限值,以代表底层水温下最浅的流体。

虽然船上孵育本身诱导对原位微生物群落的各种紊乱,但这些变化可能与潜在的微环境的光谱类似,地壳流体微生物可能在流体流动路径或海底下方的不同热调节之间经历[例如,(5.45.)]。在整个采样和制备过程中,样品在10°至15°C的原位温度范围内保持在10°至15°C。在原位压力附近尝试了大规模(1升)孵育的子集,其中流体在板上压制了液体;然而,它们形成了多云,“锈色”沉淀物,因此确定这些孵育的地球化学条件从未加压样品在本研究中可比较的情况下差异不同。

我们将结果与水热通气流体孵育的结果与整个采样和实验(表S5)进行加压(表S5),但在收集和孵化制备过程中经历了明显的温度变化(从水热通风口液温度降至〜4的底部水温下降°C有时)。用于比较的沉积物SiP-纳米乳蛋白(表S5)也经历了显着的改变,因为通过制造沉积物浆料来改变压实沉积物的原位环境的沉积物浆料加入同位素标签。因此,所有SIP-Nanosims地下沉积物或流体孵育必须从原位条件下进行一些改变,以便进行这些困难实验的实际情况,并且因此,任何这些系统的结果应被解释为潜在的活动率比直接的现场测量。

虽然在孵育过程中没有监测氧气,但在所有孵育过程中,微型宇宙应该保持充氧状态。一项对2017年收集的瓶装北池塘液体中氧气的独立研究显示,在跨越采样层孵育553天后(~300 μM),浓度(~300 μM)几乎没有变化(<4 μM变化)。5.)。提供的有机碳量(<5 μM)远低于原位氧浓度(>100 μM),因此,在孵育过程中不应足以消耗化学计量上的氧气。

细胞枚举

为了进行原位细胞计数,液体保存在标记闪烁瓶中,2 × 18ml样品,含有1.8 ml 37%的甲醛。加入固定液后摇匀,用电胶带密封,4℃保存。细胞定量采用4′,6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI) DNA染色和100×目标物在荧光显微镜(表1)。

对于孵育细胞计数,通过除去〜2ml流体来结束孵育,然后加入1.9ml 40%多聚甲醛(PFA)。每瓶均匀摇动并在4°C下储存直至岸上过滤。在每次孵育中使用DAPI DNA染色在0.22μm聚碳酸酯膜(Milliporeigma)上进行细胞密度,并在离荧光显微镜上以100×物镜观察(46.)。合并对给定的孵育条件的复制,从每次重复过3ml过滤共9mL。

硅藻溶解产物

对于硅藻裂解液的修正,Thalassiosira.sp。生长到10的密度6.毫克-1在F / 2培养基中,8.82×10-4m15.n -硝酸钠(100%添加的硝酸钠)和1m13.c -碳酸氢钠(添加碳酸氢钠的50%)。所有同位素来自剑桥同位素(tuwksbury, MA, USA)。然后将硅藻培养物离心浓缩100倍,经过3次冻融循环溶解细胞,在每个硅藻裂解液修正的微生态系统中加入200 μl的浓缩裂解液。假设在浓度步骤中没有损失,这将相当于溶解的复杂有机物的105.硅藻毫升-1孵育或4μm总c(10-12mol c / diatom)和2μm13.C-diatom。使用Redfield比率,可以得到0.6 μM的氮。因此,我们估计4 μM硅藻浓缩碳相当于2 μM13.C和4 μM15.将n加入每个硅藻裂解物条件。

DIC测量

通过蠕动泵从Tedlar液袋中通过酸清洗Masterflex Biopharm管转移到用磨砂玻璃塞和Apiezon M润滑脂密封的100毫升玻璃瓶中进行溶解无机碳(DIC)测量。瓶子和管子用10%的HCl预清洗,玻璃瓶和瓶塞随后在450°C消声清洗有机碳残留物。DIC样品用20 μl饱和HgCl保存2溶液并在室温下储存在黑暗中直至分析。在用磷酸和量化作为CO的酸化后,在AS-C3分析仪(Apollo Scitech,Newark,De,USA)上测量DIC浓度。2采用LI-COR红外气体分析仪。DIC浓度根据A.G. Dickson (Scripps Institution of Oceanography, San Diego, CA, USA)生产的认证标准物质进行校准,每个样品重复测量,重复浓度在0.1%以内,测量不确定度为2 μmol/kg。由于在回收和转移到样品瓶期间的流体处理,总的不确定性可能会稍高一些。我们对DIC浓度的保守估计为±5 μmol/kg。

医生测量

与DIC样本类似,对全部液体进行了DOC测量,并采集在用聚四氟乙烯内衬盖子密封的1000毫升琥珀玻璃瓶中。这里展示了未过滤样品的浓度。DOC浓度作为CO在国家海洋科学加速器质谱设施中测量2总检测紫外线氧化后的产量。CO.2通过测压定量测定浓度,不确定的不确定度为±2μm。在此报告的DOC浓度用于地下流体和底水类似于以前报告的那些(6.)。

元素分析和同位素质量平衡计算

预先燃烧的1.0 μm AP15玻璃纤维过滤器(MilliporeSigma)用人工海水洗涤三次,然后放在无菌培养皿中在50°C的烤箱中烘干一夜。过滤器在海洋生物实验室δ稳定同位素实验室进行分析15.N和δ13.C使用Europa 20-20连续流同位素比质谱仪,与Europa ANCA-SL元素分析仪(Sercon Ltd., Cheshire, UK)接口。同位素均质国际标准重复分析的分析精密度为±0.1‰15.N和δ13.C测量和约1%相对于%n和%c。δ15.N被测量,浓度太低,无法准确量化。13.通过使用空白过滤器的背景校正测定总颗粒C(仅燃烧并用人造海水洗涤)来计算C-Carbon掺入,通过测定总颗粒C,孵育2天和6天孵育。在所有运行中,空白过滤器的平均C浓度为0.48μmolC,SD为0.11μmol。选择在每次运行上测量的空白过滤器的平均值加1SD作为保守估计的总背景C(0.65μmolc至0.58μmolc的运行;表S1)。然后我们解决了总痣13.C被纳入生物量(N标签)使用估计的标记基板13.使用同位素标签的C分数丰度(F标签)和平均13.从没有大于14μgc的滤光器的滤光器的C分数丰度(F最初的;0.0185;表S2)。这就产生了以下等式:[N最后F最初的F最后)] / [F最初的F标签]=N标签,在那里N最后=N标签+N最初的其中initial是指实验的初始条件,final是指实验的最终条件,label是指生物质中加入的同位素标记。生成的摩尔数13.C (N最后),然后除以过滤的总体积(每个过滤器从所有重复孵育)和各自孵育的时间。硅藻样品因残存而未纳入元素分析13.C/15.在过滤器上包括N标记的硅藻颗粒。当(I)总C低于空白过滤器估计或(ii)时,样品被列为低于检测13.C丰度低于未标记生物量的估计值,两者都将导致负值N标签

使用2017年的流体地球化学,原位13.C-DIC是8.4%13.C.然而,考虑到稀释的原位DIC浓度从添加5毫升2H2O表示原子%13.C将在9到10个原子%之间13.因此,估计10%的原子%13.C被用于13.在dic修正的孵育过程中,C部分丰度可能会出现低估吸收率的错误。由于没有醋酸盐、甲胺或硅藻裂解液的测量,我们使用1.5 μM原位浓度作为估计13.C同位素稀释计算基于估计15%的低分子量DOM (~10 μM)。这估计产生了50%的原子13.c -醋酸酯,73%原子%13.C-甲胺和57原子%13.C-diatom溶解产物。2017年的铵浓度都低于检测值,但是,根据2014年的数据,它们的浓度范围在<0.02 ~ 0.15 μM之间,这将产生6.3 ~ 33原子%的富集。然而,在铵离子培养过程中观察到高达60原子%的富集(图S4),这表明2017年铵离子浓度可能更低,可能低至0.0055 μM或5.5 nM(原子%的富集为64.5)。我们还使用5.5 nM为剩余的有机氮浓度,产生99.9原子%15.n -甲胺和99.1个原子%15.N-diatom溶解产物。每项修正的最终估计数见表S3。考虑到测量误差的不确定性和C和N化合物的现场浓度的估计,这些估计被舍入到一个重要的数字。估算值均低于最大丰度分数值13.在dic修正的孵育不超过0.1 f的每种条件下测量的C13.C和其余孵育不超过0.5 f13.C或F.15.N。

对于用批量EA数据绘制的纳米级衍生的平均速率,每个孵育的细胞密度乘以平均单细胞测量。在0.22μM聚醚砜过滤器上进行细胞计数和纳米粒子,但在1.0μm玻璃纤维过滤器上进行元素分析;因此,通过元素分析可能错过了通过前两种技术分析的一些生物量。PFA固定还显示出低估生物量掺入率[碳损失10%;(47.)]。因此,元素分析很可能是对孵化期生物量总产量的较低估计。

NanoSIMS分析和单细胞速率计算

通过NanoSIMS分析12小时U1383C浅培养和深培养的子集。以浅U1383C和深U1383C样品为地壳流体深度端元,选择最小孵育时间为12小时。为进行分析,从每个重复(~144 ml)中收集细胞计数后的剩余样本,过滤(0.22-μm聚碳酸酯膜;MilliporeSigma),用人工海水洗涤,用乙醇脱水,并在分析前镀金(10 nm)。质量1 (1h),2(2H)、24日(12.C2),25(13.C12.c),26(14.N12.27 .答案为C。15.N12.C)使用加州理工学院微量分析中心的NanoSIMS-50L (Cameca, Gennevilliers Cedex, France)收集了所有样品和次级电子。聚焦初级c+预溅射后用Beam进行数据采集,以稳定离子计数。每幅图像收集3帧512 × 512像素,每个样本以随机网格模式收集。

数据采用Look@NanoSIMS软件(48.)。单独的离子图像帧被合并并使用该帧12.C14.n离子图像校正在采集期间漂移。基于细胞的感兴趣区域(ROI)由“交互式阈值”确定12.C14.N离子和2H图像。通过对所有扫描的每个像素的离子计数的总和来计算每ROI的最终离子图像和计数。对于Nanosims同位素掺入图,仅显示纳米泊氏型测量的泊松误差计数的ROI。还视觉检查rois以寻找可能影响同位素测量的潜在充电效果或边缘效应。一点校正也基于(以下)的方法应用于C和N同位素值(12.)使用聚碳酸酯过滤器的EA测量(表S1)。

使用与来自Nanosims图像的ROI尺寸信息计算的C和N相同的方法计算单细胞掺入率作为批量速率计算。首先,基于ROI的面积估计细胞体积(图S5)。然后,基于来自(1)的公式将每种细胞体积转化为每电池的FG C和FG n和FG n49.)。为了比较,每种细胞86 fg C和20 fg n的估计用于代表来自地下沉积环境的生物量估计(11.)。C (21 ~ 443 fg细胞-1)和N (6 ~ 76 fg细胞-1)遍布所有ROI绘制在图1中。S6。最大的rois由无法视觉上划分的细胞的聚集体组成。数据分析和可视化使用R(50.)与“ggplot2”(43.)、“dplyr”(51.)、“gridExtra”(52.)和“RColorBrewer”(53.)包。每次孵育的细胞计数由每天每个细胞的毫摩尔转换为每天每毫升的皮摩尔(表3)。

全球利率计算

通过将12小时单细胞纳米液率乘以原位细胞浓度(对于U1383C浅和深的3700个细胞/ ml)来计算全局速率计算,每天毫不少摩托。然后通过估计用于地壳体积与年龄的功能的1至10个功能的整体,每年将该速率转化为每立方米摩尔人(54.)。这估计了可能被海底生物圈占据的年轻(<10 Ma)地壳(1 × 10)17.m3.)乘以估计的地壳孔隙率为1% (55.),导致估计的居住孔隙率为1015.m3.。将这一估算的地壳流体量乘以单细胞速率,计算出每年的摩尔产量(表3)。

补充材料

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

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引用和笔记

致谢:我们感谢船长和船员r / v atlantis飞行员和工程师ROV Jason II.,和B. Orcutt,C. G. Neat,M.Mullis,K. Yoshimura,O.Nigro,B. Tully,G. Stewart,K. Freel,C.Sullivan和M.Rappé在完成现场计划方面提供帮助。我们感谢M. OTTER进行分析辅助和资源,用于POC同位素和质量测量;N. Hussain和W.-J.CAI用于碳酸氢盐测量的分析辅助和资源;M. Johnson成长并提供硅藻培养;V.孤儿和Y.关纳纳斯姆斯分析的访问和援助;有关这些数据的讨论,M. Serres,J.Mend和D. Larowe。资助:Gordon和Betty Moore基金会通过Grant GBMF1609赞助了北池塘的大多数天文台组件。该工作得到了国家科学基金会通过拨款NSF OCE-1745589,OCE-1635208和OCE-1062006至J.a.h。和NSF OCE-1635365至p.R.G.和s.r.s.w;NASA博士后奖学金与美国国家航空航天局天国天使天线学研究所为e.t.-r。L'Oréal美国为e.t.-r的科学奖学金妇女;和伍兹洞合作教育计划,由树林洞多样性主动提出m.a.f.o。暗能生物圈调查中心(C-Debi OCE-0939564)也支持J.A.H.的参与。和p.d.c.这是C-Debi贡献号码564。作者捐款:概念化:E.T.-,J.A.H.,S.R.S.W.和P.R.G.调查:E.T.-,M.A.F.O.,P.D.C.和S.R.S.W.写作原稿草案:e.t.-和J.A.H.写作审查和编辑:E.T.-R.,J.A.H.,S.R.S.W.和P.R.G.利益冲突:作者们宣称他们没有相互竞争的利益。数据和材料可用性:原始测序数据可通过NCBI短读档案获得,项目编号:PRJNA603242。评价论文结论所需的所有剩余数据均在论文和/或补充材料中。

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